系统性分析siRNA和mRNA特征对全化学修饰siRNA效力的影响

本研究针对化学修饰siRNA(小干扰RNA)设计规则不明确的问题，通过构建1260种不同修饰模式的siRNA库，系统评估了修饰模式、结构特征与靶标mRNA特性对基因沉默效率的影响。发现2'-O-甲基(2'-OMe)修饰水平显著影响效力，而双链结构(对称/不对称)无显著差异，并揭示靶标mRNA的剪接变体、多聚腺苷酸化位点选择和核糖体占据等特征决定siRNA效力。该研究为优化治疗性siRNA设计提供了重要框架。

　　

在RNA干扰(RNAi)治疗领域，化学修饰的小干扰RNA(siRNA)已成为革命性的基因沉默工具。自2018年以来，已有六种siRNA药物获批用于临床，但这一技术的广泛应用仍面临关键挑战：如何设计高效稳定的siRNA分子？现有设计算法主要基于未修饰siRNA数据集开发，对全化学修饰siRNA的预测性不足。更复杂的是，靶标mRNA的天然特性（如可变剪接、亚细胞定位等）与siRNA分子特征（序列、修饰模式、结构）如何协同影响沉默效率，至今缺乏系统性研究。

针对这些关键问题，来自美国马萨诸塞大学医学院的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表了突破性研究。研究人员选取了四个与阿尔茨海默病相关的靶基因（APP、BACE1、MAPT和SNCA），构建了包含约1260种不同修饰siRNA的分子库，通过双荧光素酶报告基因和天然mRNA表达检测系统，首次全面解析了化学修饰模式、双链结构与靶标mRNA特征的相互作用规律。

研究采用了多项关键技术：1）设计并合成了三种化学修饰模式的siRNA分子库（Blunt 2'-OMe/-F、Asymmetric 2'-OMe/-F和Asymmetric 2'-OMe Rich）；2）建立双报告系统（荧光素酶报告基因和QuantiGene mRNA检测）平行评估效力；3）运用RNA测序和3P测序技术解析靶基因剪接变体和多聚腺苷酸化位点使用情况；4）通过核糖体图谱分析翻译效率；5）采用随机森林机器学习算法构建siRNA效力预测模型。

化学修饰模式而非结构决定siRNA效力
研究发现siRNA双链结构（对称或不对称）对沉默效率影响有限（Pearson相关系数0.72-0.78），而2'-O-甲基(2'-OMe)修饰水平则显著影响效力。在2'-OMe富集模式中，仅15%序列在报告系统中保持活性，显著低于标准2'-OMe/-F模式的42%。热力学分析显示，有效靶点周围序列具有更低的稳定性（ΔΔG°₃₇），特别是侧翼区域。

靶标mRNA特征决定沉默效率
研究揭示了靶基因特性对siRNA效力的关键影响：1）BACE1最难被沉默（仅2%有效序列），而APP最易（30%）；2）RNA测序发现七种siRNA靶向低表达外显子导致假阴性；3）3P测序显示SNCA主要使用上游多聚腺苷酸化位点，使靶向3'UTR末端的siRNA失效；4）核糖体密度与siRNA效力呈正相关（R²=0.91），高翻译效率的SNCA（密度2.6）比低效的BACE1（密度0.6）具有更高hit率。

机器学习模型的预测效能
基于报告系统数据训练的随机森林模型对RISC（RNA诱导沉默复合体）活性预测表现良好（AUCPR_adj=0.5675），但对天然mRNA环境的预测能力有限（AUCPR_adj=0.08182），证实靶标特异性因素难以通过序列特征单独预测。

这项研究建立了化学修饰siRNA设计的系统性框架：1）优先选择2'-OMe/-F修饰模式提高RISC兼容性；2）通过RNA测序验证靶标外显子使用情况；3）关注靶基因翻译效率；4）采用"热点延伸"策略（在有效靶点周围设计新siRNA）可将hit率提升2-4倍。这些发现不仅解决了领域内长期存在的设计难题，更为神经退行性疾病等复杂疾病的RNAi治疗开发提供了实用指南。特别值得注意的是，研究揭示了靶标mRNA生物学特性对siRNA效力的决定性影响，这一发现将从根本上改变未来治疗性siRNA的筛选策略。