UniClo技术：突破序列限制的无疤痕层级DNA组装新方法

《Nucleic Acids Research》：UniClo: scarless hierarchical DNA assembly without sequence constraint

本研究团队开发了UniClo技术，通过结合载体工程、重组甲基化酶和CRISPR-dCas9空间阻断技术，解决了传统IIS型限制酶介导的DNA组装存在的序列限制和疤痕问题。该技术利用可切换甲基化酶(M.Osp807II)和非切换甲基化酶(M2.Eco31I/M2.BsaI)的协同作用，配合MP-dCas9-sgRNA复合物的定向保护，实现了含内部酶切位点的DNA片段的无疤痕层级组装。研究成功构建了含39个内部BsaI位点的10.8 kb片段，仅需3种通用载体即可完成多轮组装，为合成生物学和基因工程提供了更灵活高效的DNA组装工具。

在合成生物学和基因工程领域，DNA组装技术是构建复杂遗传回路和代谢通路的基础工具。传统IIS型限制酶(如BsaI)介导的Golden Gate和MoClo组装方法虽然高效，但存在两大瓶颈问题：一是待组装片段不能含有与组装酶相同的内部酶切位点，否则会导致片段被错误切割；二是多轮层级组装会积累不必要的"疤痕"序列，这些由载体接头产生的额外序列可能干扰基因表达调控。更棘手的是，现有解决方案如片段"驯化"(domestication)需要突变内部位点，会改变原始序列；而多载体系统则使实验设计复杂化。

牛津大学的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究中，开发了名为UniClo的创新性解决方案。这项技术通过三重策略突破现有局限：首先利用可切换甲基化酶(switch methylase)选择性保护载体位点；其次采用CRISPR-dCas9引导的空间阻断保护片段末端；最后通过精心设计的"修剪"(trimming)载体系统消除疤痕。这种组合策略不仅保留了单酶(如BsaI)组装的简便性，还实现了对含内部酶切位点片段的无疤痕层级组装。

关键技术方法包括：(1)设计甲基化可切换的载体位点，使用重组M.Osp807II甲基化酶控制BsaI活性；(2)构建MP-dCas9-sgRNA复合物，通过空间位阻保护片段末端免受M2.Eco31I/M2.BsaI甲基化酶作用；(3)开发VL/VM/VR三载体系统，通过不对称定位酶切位点实现接头序列修剪；(4)采用体外甲基化保护反应体系，实现精确的位点特异性控制；(5)通过两轮层级组装验证系统，使用含39个内部BsaI位点的11个片段构建10.8 kb大片段。

甲基化开关调控的DNA组装
研究人员首先验证了重组可切换甲基化酶M.Osp807II的调控能力。该酶能特异性甲基化载体上的"甲基化可切换"(methylation-switchable)位点，而保留"始终可切割"(always-cuttable)的内部位点活性。实验显示，经M.Osp807II处理的组装载体POC1355能正确组装4个不含内部BsaI位点的片段，成功率100%。这种体外甲基化方法比早期MetClo的细菌体内甲基化更可控。

CRISPR-dCas9介导的甲基化保护
创新性地设计了"甲基化可保护"(methylation-protectable)位点，包含sgRNA靶序列和PAM序列(NGG)。当MP-dCas9-sgRNA复合物结合时，可阻断非切换甲基化酶(如M2.Eco31I)对片段末端BsaI位点的甲基化，同时允许甲基化酶修饰片段内部的"始终可甲基化"(always-methylatable)位点。质粒POC1423的验证实验显示，该体系能精确控制特定位点的甲基化状态，为组装含内部酶切位点的片段奠定基础。

三载体修剪系统设计
为解决疤痕问题，团队设计了VL/VM/VR三种载体。VM型载体通过不对称定位BsaI位点，使切割产生的黏性末端位于载体接头序列外侧，实现双端修剪；VL和VR型分别实现右端和左端选择性修剪。这种设计仅需CTCC和TGAGAC两种通用接头序列，通过多轮修剪逐步去除接头残留，最终获得无疤痕产物。实验证明，该体系能正确组装含多个内部位点的片段，测序验证所有39个BsaI位点均被保留。

层级组装验证
通过两轮组装验证系统性能：第一轮将11个片段(每个含3-5个BsaI位点)分组组装成4个3.5-1.5 kb的中间片段；第二轮整合成10.8 kb最终产物。NotI和DraIII酶切及纳米孔测序证实组装正确率超过83%，且无序列变异。值得注意的是，甲基化保护策略使内部位点保持完整，而修剪设计确保最终产物不含任何载体来源的疤痕序列。

该研究建立了DNA组装技术的新范式。UniClo的创新性体现在三个方面：首先，甲基化保护策略突破了内部酶切位点的限制，无需片段驯化即可组装任意序列；其次，三载体修剪系统仅需两种通用接头即可完成复杂层级组装，大大简化实验设计；最后，全体外反应体系提高了可重复性和精确性。这些突破使研究人员能更自由地设计合成生物学元件，特别是在需要精确调控或含多同源序列的复杂系统中。未来，该技术框架可拓展至其他IIS型酶(如BpiI)的组装系统，为合成基因组学和代谢工程提供更强大的工具。