幽门螺杆菌CagT4SS蛋白CagN与CagM的DNA结合功能及其在非庚糖依赖性炎症底物转运中的作用机制研究

本研究针对幽门螺杆菌CagIV型分泌系统（CagT4SS）中功能未知的附属蛋白CagN和CagM展开深入探究。研究人员通过电泳迁移率变动实验（EMSA）和热位移分析（TSA）首次证实这两种蛋白具有双链DNA结合能力及核酸酶活性，并发现其能水解ATP。利用TIFA基因敲除细胞模型，揭示了CagN在非庚糖依赖性炎症底物转运中的关键作用，为阐明CagT4SS多底物转运机制提供了新见解。该成果发表于《International Journal of Medical Microbiology》，对理解幽门螺杆菌致病机理具有重要意义。

　　

幽门螺杆菌感染与胃炎、胃溃疡甚至胃癌的发生密切相关，其致病性主要依赖于cag致病岛（cagPAI）编码的IV型分泌系统（CagT4SS）。这个复杂的分子机器能向宿主细胞转运多种效应分子，包括致癌蛋白CagA、细菌代谢物和DNA。然而，对于非蛋白类底物的转运机制，特别是DNA的转运过程，科学界仍知之甚少。更令人困惑的是，CagT4SS中含有多个幽门螺杆菌特有的附属蛋白，如CagM和CagN，它们的功能长期未被阐明。这些知识空白严重制约了人们对幽门螺杆菌致病机制的全面理解。

德国汉诺威医学院的研究团队在《International Journal of Medical Microbiology》发表的重要研究中，首次系统揭示了CagN和CagM这两种特殊蛋白的生物学功能。通过多学科交叉的研究手段，研究人员不仅阐明了这些蛋白的分子特性，还发现了它们在CagT4SS底物转运中的新颖作用机制。

研究采用的主要技术包括：蛋白质-DNA相互作用分析（EMSA和TSA）、ATP酶活性检测、AlphaFold 3蛋白质结构预测、以及利用CRISPR-Cas9构建的TIFA基因敲除细胞模型进行功能验证。实验所用幽门螺杆菌菌株为N6，人类细胞系包括AGS-TIFA^k/o和HEK-luc NF-κB报告细胞。

研究结果部分，"CagN和CagM均能结合线性dsDNA片段"显示，通过EMSA实验证实两种蛋白都能与不同GC含量的双链DNA结合，其中CagM的结合亲和力比CagN高约5倍。有趣的是，这种结合似乎是非序列特异性的，暗示其在DNA转运中可能具有广谱性。

在"通过缺失和定点突变检测CagN潜在dsDNA结合区域"部分，研究人员对CagN进行了系列突变体分析。虽然预测的KFSR基序突变体仍保留DNA结合能力，但C端缺失90个氨基酸的CagN^ΔC90变体显示出结合能力减弱，提示C端结构域在DNA结合中起辅助作用。值得注意的是，这两种突变体都表现出核酸酶活性降低。

"生物物理实验验证CagN和CagM与DNA的相互作用"部分通过热位移分析（TSA）进一步确认了CagM与DNA的相互作用，测得解离常数K_D约为25μM。AlphaFold 3预测显示，在Mg²⁺和ATP存在条件下，CagM和CagN（以二聚体形式）可能通过带正电荷的氨基酸区域与DNA相互作用。

关于能量供应机制，"CagM结合ATP"和"检测CagM和CagN的ATP酶活性"两部分揭示了重要发现。虽然未能在实验中直接观测到ATP结合，但ATPase活性检测显示两种蛋白都具有ATP水解能力，其中CagM的活性比CagN高25倍。这为理解T4SS外膜复合体的能量供应提供了新视角。

最具有生理学意义的发现体现在"CagN在CagT4SS底物转运至人类靶细胞中的功能分析"部分。使用TIFA敲除细胞模型（AGS-TIFA^k/o）的研究显示，cagN突变株诱导IL-8产生的能力显著降低，而这种缺陷可通过回补全长CagN（而非CagN^ΔC90）来挽救。这一结果强烈提示CagN参与非庚糖依赖性炎症信号的转运过程，可能是通过协助DNA等底物的转运来实现。

讨论部分强调，这是首次全面揭示CagN和CagM作为DNA结合蛋白的功能特性。这些发现为理解CagT4SS的多底物转运机制提供了重要线索：1）CagM作为OMCC核心组分，可能形成DNA转运通道的一部分；2）CagN可能作为"分子伴侣"协助底物向分泌装置定向转运；3）两种蛋白的ATP酶活性提示它们可能参与外膜转运过程的能量供应。特别值得注意的是，CagN的自然蛋白水解加工可能与其功能调控密切相关，这一发现为后续研究开辟了新方向。

这项研究的科学意义在于：首先，它填补了CagT4SS附属蛋白功能认知的重要空白；其次，为幽门螺杆菌通过DNA转运激活宿主TLR9通路的机制提供了分子基础；最后，所建立的TIFA敲除细胞模型为研究T4SS底物特异性提供了新工具。这些发现不仅深化了对细菌分泌系统的认识，也为开发针对幽门螺杆菌感染的新干预策略提供了潜在靶点。