诺卡氏菌中巴西卡丁生物合成的多层级调控网络解析及其在免疫抑制药物开发中的应用

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Multiple regulators control the biosynthesis of brasilicardin in Nocardia terpenica

本研究针对诺卡氏菌(Nocardia terpenica)产生的免疫抑制剂巴西卡丁A(BraA)产量低下的问题，通过系统解析Bra-BGC基因簇中Bra12和SdpR等转录因子的调控机制，揭示了多层级转录调控网络。研究发现Bra12通过结合bra0-1和bra12启动子区域的正向调控作用，而SdpR表现出双重调控特性，为优化异源生产体系提供了新策略。该成果发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》，为开发高效低毒的免疫抑制剂奠定理论基础。

　　

在微生物天然产物药物开发领域，诺卡氏菌产生的巴西卡丁A(Brasilicardin A, BraA)因其独特的免疫抑制活性和低细胞毒性备受关注。这种三环二萜类化合物通过靶向氨基酸转运系统L发挥药理作用，在器官移植抗排斥治疗中展现出替代环孢素等传统药物的潜力。然而，其工业化生产面临两大瓶颈：一是天然产生菌Nocardia terpenica IFM 0406作为生物安全二级(BSL-2)病原体需要严格管控；二是现有半合成路线依赖的中间体BraE在异源宿主中产量极低。这些限制使得深入解析巴西卡丁生物合成基因簇(Bra-BGC)的调控机制成为突破生产瓶颈的关键科学问题。

弗罗茨瓦夫大学等机构的研究团队通过整合多组学分析和分子生物学技术，系统研究了Bra-BGC中多个转录调节因子的功能网络。研究发现，虽然该基因簇包含13个生物合成基因(bra0-bra11)和1个调控基因(bra12)，但其整体转录水平(RPKM 4.2-4.5)显著低于初级代谢基因，暗示存在严格的转录抑制。通过RNA-seq鉴定转录起始位点(TSS)后，研究聚焦于Bra12(属于SARP家族激活剂)和新发现的SdpR(金属调节蛋白家族)的调控机制。

研究采用四大关键技术：(1)RNA-seq分析33h和48h培养时期的转录组差异；(2)EMSA和DNase I足迹法鉴定Bra12/SdpR结合位点；(3)启动子-荧光素酶报告系统在链霉菌M1154中验证调控功能；(4)HPLC/MS定量分析异源宿主Amycolatopsis japonicum中巴西卡丁同系物产量。实验样本来自N. terpenica IFM 0406标准菌株，通过GPM培养基培养获取。

Multiple regulators bind within the brasilicardin gene cluster
通过EMSA筛选发现，Bra12和SdpR均可结合bra0-1基因间区(含bra0和bra1的 divergent promoter)及bra12启动子，而KstR仅结合自身操纵子区域。竞争性EMSA显示Bra12与bra0-1p_13-2片段(含双结合位点)的亲和力高于bra12p_6-16(单结合位点)，提示调控的层级差异。

Bra12 and SdpR are key regulators of brasilicardin biosynthesis
DNase I足迹揭示SdpR在自身启动子(sdpRp)存在两个保护区域(5'-GTTATATGT-3'核心序列)，而Bra12通过15bp的保守序列(5'-GGTCATATTGCCCG-3')调控靶基因。报告系统证实△bra12株中bra1p活性降低100倍，证明Bra12是bra1-bra11操纵子的主要激活剂。

The bra0-1 intergenic region is likely a key regulatory "hot-spot"
该区域同时含有Bra12正向调控元件和SdpR抑制元件。异源表达实验显示：过表达Bra12使产量提升296%，而△sdpR突变株产量增加397%，表明SdpR通过抑制bra12表达间接负调控生物合成。

这项研究首次绘制了Bra-BGC的多因子调控网络模型：Bra12作为核心激活剂，通过自动调节其自身表达并激活bra0-bra11途径基因；SdpR则通过结合bra0-1区的抑制元件形成精细调控。该发现为通过改造调控元件提高BraE产量提供了明确靶点，例如构建△sdpR/bra12过表达组合菌株。从更广泛的视角看，这种"调控热点"区多重因子协同作用的模式，为解析放线菌次级代谢簇的复杂调控提供了新范式。论文中建立的异源生产系统已实现巴西卡丁的克级制备，为开发新一代免疫抑制剂奠定了关键技术基础。