大鼠血浆中奈韦拉平、福沙那韦钙及其代谢产物安普那韦的反相高效液相色谱生物分析方法开发与验证

本研究针对抗HIV药物奈韦拉平(NVP)、福沙那韦钙(FPV)及其代谢产物安普那韦(APV)的血药浓度监测需求，开发了一种基于反相高效液相色谱(RP-HPLC)的同步检测方法。研究人员通过优化甲醇-水-乙腈(80:20:2)流动相体系，在ODS C-18色谱柱上实现三组分完全分离(NVP 8.705 min、FPV 11.923 min、APV 14.391 min)，验证显示线性范围0.2-3.2 μg/mL(r2>0.9879)，RSD<2%，为抗HIV联合用药的PK/PD研究提供了可靠分析工具。

　　

在全球艾滋病防治进入第41个年头之际，HIV感染者的药物治疗监测仍面临重大挑战。抗逆转录病毒治疗(ART)需要组合使用不同机制药物，如非核苷类逆转录酶抑制剂(NVP)和蛋白酶抑制剂(FPV/APV)，但药物联用可能导致复杂的药代动力学相互作用。更棘手的是，作为前药的FPV需在体内转化为活性代谢物APV才能发挥疗效，这使得血药浓度监测变得尤为关键。传统分析方法难以同步检测母药与代谢物，且现有方法多存在灵敏度不足、耗时长等问题，严重制约着临床用药方案的优化调整。

为解决这一技术瓶颈，来自Lovely Professional University的研究团队在《Journal of Chromatography B》发表创新成果。他们建立了一种同步检测大鼠血浆中NVP、FPV及其代谢物APV的反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法，通过系统性方法开发与验证，为抗HIV联合用药研究提供了精准分析工具。

研究采用三大关键技术：紫外光谱法确定最佳检测波长(258 nm等吸收点)；优化色谱条件采用ODS C-18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)与甲醇-水-乙腈(80:20:2)流动相；方法验证严格遵循ICH Q2(R1)指南，包括81只雌性Wistar大鼠血浆样本的预处理(离心5213g，蛋白沉淀用丙酮-乙酸1:1混合液)。

3.1. 紫外波长选择
通过扫描200-400 nm紫外光谱，确定FPV/APV最大吸收265 nm，NVP为283 nm，最终选择258 nm等吸收点作为检测波长，实现三组分同步检测。

3.2. 方法开发与优化
经多轮溶剂系统筛选，最终确立甲醇-水-乙腈(80:20:2)体系，流速0.5 mL/min，三组分保留时间分离良好(NVP 8.705 min、FPV 11.923 min、APV 14.391 min)，理论塔板数>2000，拖尾因子<1.05。

3.3. 方法验证
线性范围0.2-3.2 μg/mL，相关系数r²达0.9879-0.9916；准确度试验显示回收率95-105%；精密度考察中，日内、日间RSD均<2%；LOD/LOQ分别为0.02-1.1 μg/mL和0.1-3 μg/mL。

3.8. 稳定性研究
冻融循环、短期(3h室温)和长期(3周-20°C)稳定性试验显示各浓度回收率>95%，RSD<2%，证明方法适用于实际样本分析。

这项研究首次建立了可同步检测NVP、FPV及其活性代谢物APV的RP-HPLC方法，填补了联合用药监测的技术空白。该方法具有三大突出优势：一是采用等度洗脱简化操作流程；二是通过258 nm等吸收点实现多组分同步检测；三是验证参数全面符合ICH标准。特别值得注意的是，研究团队创新性地采用丙酮-乙酸(1:1)蛋白沉淀法，有效解决了血浆样本预处理难题。这些突破为HIV联合用药的药代动力学研究、治疗药物监测(TDM)以及个体化给药方案制定提供了关键技术支撑，对提高抗病毒治疗效果、减少耐药发生具有重要临床意义。未来可进一步拓展至LC-MS/MS等更高灵敏度技术的开发，以满足更低浓度药物的检测需求。