双靶向CAR-T疗法（GPC3/AFP）在肝癌治疗中的突破性进展：增强抗肿瘤活性与持久性

肝癌治疗面临肿瘤异质性和抗原逃逸等挑战，研究人员创新性开发了同时靶向GPC3和AFP158-166/HLA-A*02:01的双靶向CAR-T细胞疗法，通过整合BiTE（双特异性T细胞衔接器）技术，显著提升了CAR-T细胞的增殖能力、持久性和抗肿瘤效果。该研究为肝癌患者提供了更高效且安全的治疗选择，相关成果发表于《Journal of Nanobiotechnology》。

　　

肝癌是全球范围内发病率和死亡率极高的恶性肿瘤，尤其在中国，乙肝病毒感染导致的肝癌病例占据了相当大的比例。尽管近年来免疫治疗如PD-1/PD-L1抑制剂和抗血管生成药物的联合应用（如atezolizumab联合bevacizumab）取得了一定进展，但晚期肝癌患者的生存率仍不理想。传统的治疗手段如手术切除、放疗和化疗对晚期患者效果有限，亟需开发更有效的治疗策略。

在这一背景下，CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）疗法因其在血液肿瘤中的显著疗效而备受关注。然而，CAR-T在实体瘤中的应用面临诸多挑战，包括肿瘤微环境的抑制、抗原异质性以及靶向抗原的局限性。肝癌中，Glypican-3（GPC3）和甲胎蛋白（Alpha-fetoprotein, AFP）是两个备受关注的靶点。GPC3是一种在肝癌细胞表面高表达的糖蛋白，而AFP是一种经典的肝癌生物标志物，其肽段可通过HLA-A*02:01分子呈递至细胞表面。然而，单一靶向的CAR-T疗法往往因抗原逃逸或肿瘤异质性而疗效受限。

为了解决这些问题，来自广州第一人民医院、广东医科大学附属东莞松山湖中心医院、珠海市人民医院等机构的研究团队开展了一项创新性研究，开发了一种双靶向CAR-T疗法，同时靶向GPC3和AFP_158-166/HLA-A02:01复合物。研究团队首先通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的AFP特异性抗体（1B3），并构建了靶向AFP_158-166/HLA-A02:01的CAR-T细胞。随后，他们将这一策略与已有的GPC3 CAR-T技术结合，进一步优化了CAR-T细胞的设计，使其能够分泌AFP-CD3 BiTE分子，从而招募和激活内源性T细胞，形成协同抗肿瘤效应。

研究团队采用了多项关键技术方法，包括：1）通过噬菌体展示和液相筛选技术获得高亲和力AFP特异性抗体；2）利用SEC-HPLC和ForteBio Octet技术分析抗体与抗原复合物的纯度和亲和力；3）构建双靶向CAR-T细胞，并通过体外细胞毒性实验和重复刺激实验评估其功能；4）建立小鼠异种移植模型，验证CAR-T细胞的体内疗效和安全性；5）通过转录组测序分析CAR-T细胞的基因表达特征。

研究结果分为以下几个部分：

AFP和GPC3在肝癌中的表达分析
通过数据库分析和临床样本验证，研究团队发现AFP和GPC3在肝癌组织中显著高表达，而在正常组织中表达水平极低。免疫组化结果显示，约50.77%的肝癌患者AFP阳性，70.77% GPC3阳性，38.46%同时表达两种抗原，这为双靶向策略提供了理论基础。

高亲和力AFP特异性抗体的开发
研究团队成功构建了hAFP_158-166/HLA-A02:01复合物，并通过噬菌体筛选获得了五种候选抗体。其中，1B3抗体表现出最高的亲和力（KD=0.504 nM），且对HLA-A02:07也有交叉反应，扩大了潜在适用人群。

体外功能评估
1B3 CAR-T细胞在体外展现出强大的细胞毒性，能够特异性杀伤表达AFP_158-166/HLA-A*02:01的肿瘤细胞，同时分泌较低水平的细胞因子（如IFN-γ和IL-2），表明其具有良好的安全性。

体内疗效验证
在小鼠模型中，1B3 CAR-T细胞显著抑制肿瘤生长，且低剂量（3×10⁵细胞）即可达到显著疗效。此外，CAR-T细胞在体内表现出持久性和记忆表型，能够有效抑制肿瘤复发。

双靶向CAR-T细胞的优化
研究团队进一步将AFP-CD3 BiTE整合到GPC3 CAR-T细胞中，构建了GPC3 CAR-T-AFP-CD3细胞。转录组分析显示，这些细胞具有独特的基因表达谱，包括上调的细胞因子（如TNF和CD40LG）和增强的DNA损伤修复能力。体内实验证实，GPC3 CAR-T-AFP-CD3细胞能够显著抑制肿瘤生长，并延长小鼠生存期。

研究结论与意义
该研究成功开发了一种双靶向CAR-T疗法，通过同时靶向GPC3和AFP_158-166/HLA-A*02:01，显著提升了CAR-T细胞的抗肿瘤活性和持久性。BiTE技术的引入进一步增强了CAR-T细胞的功能，使其能够克服肿瘤异质性和抗原逃逸。这一策略为肝癌患者提供了新的治疗选择，并有望扩展到其他实体瘤的治疗中。研究结果发表于《Journal of Nanobiotechnology》，为CAR-T疗法的优化和临床应用提供了重要参考。