新型锌结合七肽作为重组蛋白纯化替代标签的开发与评价

本研究针对传统多组氨酸标签(His-tag)在IMAC(固定化金属离子亲和层析)中存在的非特异性结合等问题，设计开发了含His6/Cys7等位点的乙酰化七肽标签(HCHC/DCHC/DDHC)，通过离子淌度-质谱(IM-MS)和紫外分析证实，HCHC在pH 8条件下对锌螯合树脂具有选择性结合能力，并可通过pH 3.9或咪唑洗脱，为重组蛋白纯化提供了新型标签选择。

　　

在生物制药领域，重组蛋白的高效纯化始终是制约生产的关键环节。目前广泛采用的6×His或7×His标签虽然能通过固定化金属离子亲和层析(IMAC)实现快速纯化，但其固有缺陷日益凸显：非特异性结合干扰下游应用、组氨酸残基可能引发免疫原性反应，且在高盐条件下结合稳定性欠佳。更棘手的是，某些治疗性蛋白（如抗体药物）的活性位点可能因His-tag的空间位阻而受到影响。这些瓶颈促使科学家们探索兼具高亲和力与特异性的新型蛋白标签。

针对这一需求，由Richmond A. Adomako和Michael B. Owusu等研究者组成的团队在《Journal of Inorganic Biochemistry》发表了突破性研究。他们创新性地设计了一类含多重金属配位位点的七肽标签，其核心序列为乙酰-Aa₁-Aa₂-Gly₃-Pro₄-Aa₅-His₆-Cys₇，通过系统比较HCHC（His₁-Cys₂）、DCHC（Asp₁-Cys₂）和DDHC（Asp₁-Asp₂）三种变体与7×His标签的性能差异，首次证实含双硫醇配体的HCHC肽在锌螯合树脂上展现出独特的结合特性。

研究采用离子淌度-质谱(IM-MS)和紫外光谱联用技术，建立了定量评价标签结合效能的创新方法。特别值得注意的是，团队引入不结合锌的六肽作为内标，通过竞争性结合实验精确量化不同pH(5.4-9.8)条件下各肽段的锌亲和力。针对实际纯化场景，还模拟了IMAC常规操作条件（pH 8结合/pH 3.9洗脱）进行验证。

Competitive formation of [ZBP + Zn(II)] complex
在生理pH 7.4条件下，HCHC和DCHC的[ZBP+Zn]^n-复合物形成率分别达到65-67%，显著高于DDHC（38%）和7×His标签（52%）。质谱数据显示，HCHC能形成稳定的[ZBP+Zn]^2-双电荷复合物，提示其可能通过His₆的咪唑基与Cys₇的硫醇基构成双齿配位模式。

Relative formation of [ZBP + Zn] complex
当pH升至8.0（IMAC典型结合条件）时，HCHC的锌结合优势更为明显。引人注目的是，将Tyr₅替换为Gly₅的变体HCGHC结合效率下降约15%，证实酪氨酸酚羟基通过π-锌阳离子相互作用辅助稳定复合物构象。

Conclusions
研究最终确定HCHC七肽具有三重优势：1）在pH 8.0时对锌树脂的负载量达到7×His标签的82%；2）可采用温和的pH 3.9条件完全洗脱，避免强酸对目标蛋白的损伤；3）Cys₇的还原性还能防止肽段氧化失活。这些特性使其特别适用于对His-tag敏感的抗体类药物纯化。

该研究不仅为IMAC技术提供了首个基于Cys/His协同配位的替代标签，更开创了"可编程肽标签"设计新思路——通过精确排列不同配体氨基酸（His/Cys/Asp/Tyr），可定制开发适应特定金属离子（Ni²⁺/Co²⁺/Cu²⁺）的纯化系统。正如作者指出，这种模块化设计未来还可整合细胞穿透肽(CPP)或核定位信号(NLS)，实现纯化-递送一体化，为下一代生物制剂开发提供全新工具。