解锁转氨酶应用潜能：通过随机诱变技术提升河流弧菌转氨酶的热稳定性与pH稳定性

本研究针对ω-转氨酶(ω-TAs)工业应用中存在的热稳定性与pH稳定性不足的瓶颈问题，通过建立高通量裂解缓冲液体系，结合易错PCR(epPCR)和MEGAWHOP克隆技术，成功构建含35块96孔板的Vfat随机突变体文库（突变频率2 kb-1）。筛选获得初始活性提升5倍、耐热性增强6倍且保持碱性pH活性的优势突变体，为转氨基反应工业化提供了新型生物催化剂。

　　

在生物催化领域，ω-转氨酶(ω-TAs)因其卓越的对映选择性成为合成手性胺的关键工具。这类酶能以吡哆醛5'-磷酸(PLP)为辅因子，通过单步反应实现从前手性酮到光学纯胺的高效转化。然而工业应用面临严峻挑战：天然酶在高温和极端pH条件下稳定性差，难以满足生产需求。以河流弧菌(Vibrio fluvialis)来源的Vfat转氨酶为例，虽然其晶体结构（~56×88×97 ?二聚体）和广谱胺供体特异性颇具优势，但操作稳定性缺陷长期制约其工业化进程。传统理性设计虽能改善底物特异性，但对复杂稳定性问题的预测仍力不从心。

针对这一难题，研究人员创新性地采用随机诱变策略。通过开发新型裂解缓冲液实现96孔板高通量筛选，结合易错PCR(epPCR)构建突变文库，采用MEGAWHOP全质粒扩增技术完成克隆。最终获得3500余个突变体，关键突变体展现出突破性性能：初始活性达野生型5倍，55℃处理后半衰期延长6倍，在pH 10条件下仍保持完整活性。这些发现不仅证实随机诱变对转氨酶改造的有效性，更建立了适用于ω-TAs的高通量改造平台。

关键技术方法
研究采用epPCR引入随机突变，通过MEGAWHOP技术将突变片段克隆至pET28α(+)载体。创新性开发化学裂解缓冲液替代传统超声破碎，实现96孔板规模的高通量酶活检测。筛选体系包含温度挑战（55℃）和碱性pH（10.0）双重压力选择。

结果与讨论
裂解缓冲液开发：优化配方实现大肠杆菌高效裂解，酶活回收率>90%，成本仅为商业试剂BugBusterTM的1/5。
突变文库构建：突变频率控制在2 kb^-1，确保每个突变体含2-3个氨基酸替换，平衡多样性筛选需求。
性能提升机制：热稳定突变体关键位点集中于二聚界面（如Q152L），pH稳定突变则多带正电荷残基（R129K），推测通过增强静电相互作用维持PLP结合口袋构象。

结论与意义
该研究首次证实随机诱变对转氨酶稳定性改造的普适性价值。获得的Vfat突变体突破天然酶局限，在保持严格对映选择性的同时，操作窗口拓宽至工业需求范围。建立的"裂解缓冲液-高通量筛选"技术体系为其他氧化还原酶改造提供范本。研究结果发表于《Biochemical Engineering Journal》，为生物催化绿色制造手性药物中间体奠定基础。