Givinostat通过挽救胱硫醚β-合成酶(CBS)折叠改善小鼠高胱氨酸尿症的药理学机制研究

本研究针对由胱硫醚β-合成酶(CBS)基因错义突变导致的高胱氨酸尿症(HCU)，开发了基于分裂荧光蛋白互补的CBS折叠报告系统，通过筛选FDA批准药物库发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)givinostat能直接结合CBS并调控蛋白质稳态网络，显著恢复CBS I278T变体的折叠与活性，短期治疗可使模型小鼠血清同型半胱氨酸水平降低25%，为HCU的精准治疗提供了新策略。

　　

高胱氨酸尿症(HCU)是一种因胱硫醚β-合成酶(CBS)基因突变引发的罕见代谢疾病，患者体内同型半胱氨酸(Hcy)异常蓄积导致多系统损害。尽管限制甲硫氨酸摄入和补充维生素B₆可缓解部分症状，但针对致病根源——CBS蛋白错误折叠的治疗手段仍属空白。传统药物筛选方法如热位移分析(TSA)依赖纯化蛋白，无法模拟细胞内复杂环境，而蛋白降解抑制剂虽能暂时稳定突变CBS，却因严重副作用难以长期应用。

瑞士弗里堡大学Tomas Majtan团队在《Biochemical Pharmacology》发表研究，创新性地构建了基于mNeonGreen2(mNG2)分裂荧光蛋白的CBS折叠报告系统。该体系将mNG2_1-10片段与CBS-mNG2₁₁融合蛋白共表达，当CBS正确折叠时可重建荧光信号。研究人员通过该技术筛选3793种化合物，结合活细胞硫化氢(H₂S)探针AzMC检测酶活性，发现HDAC抑制剂givinostat(GIV)能双重调控CBS I278T变体：直接结合CBS45催化核心(KD=30μM)诱导构象变化，同时上调Hsp70/Hsp40并抑制Hsp27/Hsp22表达，使突变蛋白半衰期从8.3小时延长至18.7小时。在转基因I278T小鼠中，25mg/kg/天的GIV治疗3周使肝脏CBS表达提升，血清tHcy水平从420μM降至313μM。

关键技术包括：1）建立基于mNG2分裂荧光互补的CBS折叠报告系统；2）高通量筛选FDA批准药物库；3）微量热泳动(MST)测定药物-蛋白相互作用；4）圆二色谱(CD)分析蛋白构象变化；5）转基因HCU小鼠模型验证。

研究结果显示：

1. 新型CBS折叠报告系统的开发：mNG2-CBS WT产生强荧光信号而I278T变体仅呈现弥散背景，Z'因子达0.88满足高通量筛选要求。Western blot证实I278T表达量仅为WT的30%，酶活性降低200倍。
2. 化合物库筛选验证：在33个初筛命中化合物中，HDAC抑制剂GIV使CBS I278T荧光信号恢复至WT的80%，酶活性提升3倍，且细胞毒性低于蛋白酶体抑制剂MG-132。
3. GIV的作用机制：CD光谱显示GIV改变CBS45的PLP辅基(410nm)和血红素区(450-700nm)构象；Western blot揭示其上调Hsp90/Hsp70/Hsp40表达2-3倍，同时使Hsp27/Hsp22降低50%。
4. 动物模型验证：GIV治疗使Tg-I278T小鼠肝脏CBS表达增加25%，但酶活性仅轻微提升，提示部分折叠的CBS可能仍存在催化缺陷。

该研究首次建立适用于HCU的药物筛选平台，揭示HDAC抑制剂通过重塑蛋白质稳态网络挽救致病蛋白折叠的新机制。虽然GIV短期内未能完全纠正代谢异常，但其口服给药优势为开发更高效的HDAC抑制剂奠定基础。未来可针对不同CBS突变开发个性化折叠校正方案，该策略也有望拓展至其他蛋白质错误折叠疾病。