IL-2/IL-21双重激活联合CD16V-CAR/TRAIL工程化NK细胞与单抗协同增强抗肿瘤功能的研究

为解决NK细胞疗法在肿瘤杀伤功能不足和适应性受限的问题，研究人员通过IL-2/IL-21双重细胞因子预激活联合CD16V-CAR（高亲和力CD16变体）和膜结合TRAIL（mbTRAIL）的基因工程改造，显著提升了NK101细胞系的ADCC（抗体依赖性细胞毒性）和凋亡诱导能力。该研究在淋巴瘤小鼠模型中实现完全肿瘤消退，为下一代NK细胞免疫治疗提供了可扩展的设计框架。

　　

自然杀伤（NK）细胞作为先天免疫系统的核心效应细胞，具有无需主要组织相容性复合体（MHC）限制的肿瘤识别能力，但其临床应用面临细胞毒性不足、体内持久性差和肿瘤微环境抑制等挑战。尽管CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）疗法取得突破，NK细胞因其安全性更高、可异体使用等优势成为新兴选择，但现有NK细胞平台（如NK-92细胞系）存在功能单一、扩增受限等问题。

针对这一瓶颈，研究人员以NK101细胞系（一种表型类似CD56^dimCD62L⁺中间态亚群的人类NK细胞系）为模型，通过多维度优化策略突破功能限制。首先通过细胞因子筛选发现IL-21单用即可诱导颗粒酶B（granzyme B）水平提升167倍，而IL-2+IL-21组合在维持增殖能力的同时协同增强IFN-γ分泌。转录组分析揭示该组合特异性激活JAK3/STAT1通路，并上调GZMB、PRF1等细胞毒性基因。基于此，研究团队进一步构建了表达CD16V-CAR（整合CD28跨膜域和DAP10/DAP12/CD3ζ信号域）和膜结合TRAIL（mbTRAIL）的双基因工程化NK101-16V-TR细胞，通过流式细胞术验证其表面标志物表达率达87.8%。

关键实验技术包括：1）细胞因子刺激与功能检测（ELISA、流式细胞术）；2）RNA测序与生物信息学分析；3）基因工程改造（慢病毒转导CD16V-CAR和mbTRAIL）；4）体外杀伤实验（Annexin V/活性染料双标法）；5）Jeko-1淋巴瘤异种移植模型（生物发光成像评估疗效）。

3.1 细胞因子筛选
通过10种γc和IL-12家族细胞因子的系统筛选，发现IL-21单用即可使颗粒酶B分泌量达77 ng/mL（较IL-2提高167倍），而IL-15主导增殖（8.1倍扩增）。IL-2+IL-21组合在维持细胞扩增（6.1倍）的同时，使IFN-γ分泌量提升9倍，凸显协同效应。

3.2 组合优化验证
在6种肿瘤细胞系（包括K562、Raji等）的杀伤实验中，IL-2+IL-21组对Jeko-1的特异性杀伤率达68%，显著高于单用IL-2（42%）。值得注意的是，IL-15的加入反而抑制IL-21的细胞毒性增强作用，表明精准配伍的必要性。

3.3 分子机制解析
PCA分析显示IL-2+IL-21组形成独特转录簇，GO分析显示颗粒酶介导的凋亡通路富集评分达78。免疫表型分析发现该组合下调NKG2D/NKp30等激活受体，但显著提升ICAM-1（4.3倍）和DNAM-1（2.1倍）表达，塑造出高迁移-高杀伤表型。

3.4-3.5 基因工程改造
CD16V-CAR工程化使NK101-16V细胞对利妥昔单抗的ADCC效率提升3倍（Jeko-1模型中特异性杀伤率从35%增至72%）。叠加mbTRAIL表达后，NK101-16V-TR细胞对传统TRAIL耐药的K562细胞杀伤率仍达54%，证实双通路协同优势。

3.6 体内疗效验证
在NOD/SCID小鼠模型中，IL-2+IL-21预激活的NK101-16V-TR联合利妥昔单抗组实现100%肿瘤完全缓解（BLI信号降低至检测限以下），显著优于单药组（NK细胞组肿瘤负荷降低66%）。

该研究创新性地提出"细胞因子预激活-双基因改造-抗体协同"的三联策略：IL-2+IL-21预激活解决NK101颗粒酶储备不足的固有缺陷；CD16V-CAR提供灵活靶向性并放大单抗疗效；mbTRAIL则通过死亡受体通路克服颗粒耗尽后的功能衰减。相比现有临床阶段产品如haNK（单纯CD16高表达）或FT596（内置IL-15信号），该设计兼具可调控性和多功能性，尤其适合与PD-1/PD-L1抑制剂等联用。论文发表于《Biomedicine》杂志，为实体瘤治疗提供了新的组合疗法开发范式。