基于多策略协同定向进化与计算设计的角质酶热稳定性迭代增强研究

为解决工业酶在高温条件下易失活的问题，研究人员通过整合易错PCR、计算设计和机器学习策略，对Humicola insolens角质酶(HiC)进行多轮迭代改造，获得八重突变体M8。该突变体在65℃和70℃下的半衰期(t1/2)分别提升8110倍和3982倍，熔解温度(Tm)提高13.0℃，为α/β-水解酶家族的热稳定性改造提供了方法论框架。

　　

在追求绿色制造的今天，工业酶制剂正成为替代传统化学工艺的明星选手。其中，源自真菌Humicola insolens的角质酶(HiC)因其能高效降解聚酯材料、处理纺织品和催化工业反应而备受关注。然而，当遇到造纸回收过程中的高温环境时，这些生物催化剂就会像烈日下的冰淇淋一样迅速"融化"——酶蛋白结构瓦解，催化活性丧失。这成为制约酶法回收废纸技术推广的"卡脖子"难题，那些黏糊糊的压敏胶和聚酯类粘合剂，依然顽固地降低着再生纸的品质。

面对这一挑战，中国的研究团队开启了一场"蛋白质热装甲"的锻造计划。他们创造性地将实验室里的"试错法"（易错PCR）与计算机模拟的"先知算法"相结合，就像同时运用铁匠的锤子和工程师的CAD软件来锻造酶分子。经过多轮迭代优化，最终获得的八重突变体M8交出了惊艳的成绩单：在65℃高温下的存活时间比野生型延长了8110倍，70℃极端条件下仍能坚持3982倍时长。差示扫描量热仪显示其分子"骨架"更加坚固，熔解温度(T_m)提升了13.0℃。更难得的是，这些强化改造没有牺牲酶的"工作能力"——在标准测试温度下保持全效催化活性，且适应更宽的pH范围。

研究采用的核心技术包括：建立96孔板高通量筛选平台进行易错PCR文库筛选；运用Fireprot、PROSS等算法进行稳定性预测；通过分子动力学(MD)模拟分析蛋白结构动态变化；采用差示扫描量热法(DSC)测定T_m值；使用pET20b(+)载体系统在E. coli BL21(DE3)中实现异源表达。

【Thermostability enhancement of HiC via random mutagenesis】
通过优化MnCl₂浓度(0.15 mM)建立易错PCR文库，筛选获得关键单点突变体M1(D145G)和M2(S166P)，其T_m分别提高3.2℃和4.1℃。

【Machine learning-guided computational design】
采用B-FITTER识别B-factor值高的柔性区域，结合Consensus Finder进行系统发育分析，设计出四重突变体M4，使T₅₀⁶⁰（60分钟失活温度）提升14.3℃。

【Iterative recombination of beneficial mutations】
通过多轮组合优化获得最终八重突变体M8，在65℃和70℃下的t_1/2分别达398分钟和95分钟，较野生型(2.93分钟和1.43分钟)显著延长。

【Structural and mechanistic insights】
MD模拟显示突变引起表面静电重分布，RMSD值降低23%，蛋白刚性增强。结构分析发现新增的盐桥网络和疏水核心优化是热稳定性提升的关键因素。

这项研究不仅创造了具有工业应用价值的超稳定角质酶，更建立了"定向进化+计算设计+机器学习"的三维蛋白工程范式。特别值得注意的是，26.2℃的T₅₀⁶⁰提升幅度创下角质酶改造纪录，而突变体在碱性环境(pH 9.0)下的活性保留率从47%提升至82%，完美契合造纸工业的工艺需求。研究揭示的"表面电荷重排-结构紧缩"热稳定机制，为α/β-水解酶家族的理性设计提供了普适性指导。正如研究者Shiheng Chen团队强调的，这种多策略融合的方法论框架，可延伸应用于其他工业酶的热适应改造，为生物制造在高温工艺场景的推广应用铺平道路。