靶向DnaA起始蛋白的ClpP蛋白酶介导膜应激反应阻断染色体复制的新机制

这篇研究揭示了革兰阴性菌中膜应激反应的全新调控路径：当脂蛋白(Lpp)成熟受阻时，通过Rcs应激通路激活ClpP蛋白酶降解复制起始因子DnaA，从而阻断染色体复制。该机制独立于已知的Lon蛋白酶和(p)ppGpp信号系统，为细菌感染治疗提供了新靶点。研究通过Δcrp和Δfis突变体实验证实DnaA稳定性是决定细胞生长停滞的关键因素。

　　

膜应激反应阻断染色体复制的分子机制

ABSTRACT
在大肠杆菌中，脂蛋白(Lpp)成熟受阻导致的膜应激会损害DNA复制并阻滞细胞生长。研究发现这种生长停滞源于Rcs应激通路的激活和复制起始因子DnaA的降解。与典型应激响应不同，该过程不依赖Lon蛋白酶或(p)ppGpp信号分子，而是通过ClpP蛋白酶特异性降解DnaA实现。ΔclpP菌株中DnaA保持稳定，复制不受抑制；而野生型菌株过表达DnaA会因复制过度起始致死。研究还发现Δcrp和Δfis突变体能抵抗膜应激，揭示了新的调控节点。

INTRODUCTION
革兰阴性菌的细胞膜由外膜(OM)和内膜(IM)构成，其间肽聚糖层通过最丰富的脂蛋白Lpp（约10⁶个/细胞）与OM交联。Lpp前体(pLpp)在IM中经历二酰甘油(DG)修饰和LspA酶切割的成熟过程。阻断该过程（如用globomycin抑制LspA或表达pLpp(C21G)突变体）会导致中间产物积累，引发膜应激。

DnaA作为复制起始因子，其膜结合域（AAA⁺结构域中的L366残基）与膜状态密切相关。此前研究发现，过表达膜结合缺陷型DnaA突变体可挽救pgsA缺失菌株的生长停滞，暗示DnaA可能是膜应激的效应靶点。

RESULTS
DnaA降解是生长停滞的关键因素
通过诱导pLpp(C21G)表达或globomycin处理，研究者观察到DnaA蛋白水平显著下降，伴随复制起始频率降低。流式细胞术显示应激诱导后出现单染色体峰，表明新复制被阻断。ΔdnaA菌株（依赖质粒ori维持复制）对膜应激具有抗性，证实DnaA是特异性靶点。

Rcs应激通路被激活但Lon非必需
膜应激诱导了典型的Rcs响应：qRT-PCR显示rcsA、cpsB和cpsG基因表达上调，菌落呈现黏液表型。但Δlon菌株仍出现DnaA降解和生长停滞，排除了Lon蛋白酶和(p)ppGpp信号的参与。

ClpP蛋白酶的核心作用
ΔclpP菌株在应激条件下保持DnaA稳定性和正常复制，而回补clpP基因恢复生长抑制表型。免疫印迹证实ClpP直接介导DnaA降解，这是首个报道的ClpP调控染色体复制的案例。

CRP和Fis的调控网络
Δcrp背景中，适度过表达DnaA可克服生长停滞，而野生型会因过度起始致死。Δfis菌株则天然抵抗膜应激，保持DnaA稳定。这些发现揭示了Fis可能通过调控pLpp积累影响应激信号传导。

DISCUSSION
该研究阐明了一条新型膜应激信号通路：未成熟Lpp积累→Rcs激活→ClpP介导DnaA降解→复制阻滞。与经典应激响应不同，该路径独立于Lon和(p)ppGpp，且需要Fis参与。研究为理解细菌细胞周期检查点提供了新视角，针对高度保守的DnaA蛋白的调控机制，可能为应对β-内酰胺类耐药菌感染开辟新途径。

MATERIALS AND METHODS
实验采用大肠杆菌K-12衍生株，通过生长曲线、免疫印迹、流式细胞术和qRT-PCR等方法分析。关键菌株包括Δlon、ΔclpP、Δcrp和Δfis突变体，质粒携带Plac-lpp(C21G)或PBAD-dnaA等构建体。globomycin处理浓度为10μg/mL，IPTG诱导浓度为50μM。