irpT基因通过调控细胞色素c影响乳酸乳球菌N8多重胁迫耐受性的机制研究

为解决乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)在食品工业和医学应用中面临的胁迫耐受性不足及抗菌肽产量受限问题，研究人员通过Cre-loxP系统构建irpT基因敲除株，发现该基因缺失显著降低细胞色素c含量，增强菌株对溶菌酶、乳酸及抗生素的多重胁迫抗性，并提升Nisin产量。该研究为乳酸菌胁迫响应机制提供了新见解，对优化益生菌应用具有重要价值。

　　

在食品发酵和生物保鲜领域，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作为公认安全的革兰氏阳性菌，其产生的抗菌肽Nisin被广泛用作天然防腐剂。然而，菌株在工业生产中常面临酸胁迫、渗透压和抗生素等多重环境压力，且Nisin产量受限成为行业瓶颈。更棘手的是，现有研究对乳酸菌胁迫响应机制的认识仍不完善，特别是关于未知基因irpT的功能解析尚属空白。

针对这些挑战，中国某研究机构团队在《Current Research in Microbial Sciences》发表重要成果。研究人员以L. lactis N8及其噬菌体裂解酶基因ply10300缺失株为模型，采用Cre-loxP重组系统构建irpT单敲和双敲突变株，结合生长曲线分析、ELISA检测和生物信息学预测等技术，首次揭示该基因通过调控细胞色素c合成影响菌株多重胁迫抗性的分子机制。

关键实验方法
研究通过电转化将pNZ5319质粒导入受体菌，经两次同源重组和Cre酶介导的cat基因切除获得突变株；采用96孔板动态监测法分析菌株在不同浓度Nisin（5000-7500 IU/mL）和乳酸（0.34%-0.36%）下的生长曲线；通过牛津杯扩散法测定Nisin产量；使用ELISA试剂盒定量细胞色素c含量；借助Swiss-Model和Uniprot数据库进行蛋白功能预测。

主要研究结果
3.1 突变株构建
成功获得L. lactis N8ΔirpT和N8Δply10300ΔirpT双敲株，PCR验证显示loxP位点正确保留。

3.2 Nisin耐受性提升
在7500 IU/mL Nisin条件下，双敲株进入稳定期时间较野生型提前1-2小时，且Δply10300ΔirpT株生长速率显著优于单敲株（P<0.01）。

3.3 Nisin产量增加
突变株Nisin产量提高约15%，但过表达nisI/nisZ基因未能进一步增产，提示存在产量上限。

3.4-3.5 多重胁迫抗性增强
溶菌酶（8 mg/mL）处理2小时后，双敲株存活率较野生型提高11.3%；0.36%乳酸环境中其OD₆₀₀增长速率更快。

3.6 抗生素抗性分化
对氯霉素（85 μg/mL）的抗性显著提升（P<0.001），但对红霉素敏感，表明抗性机制具有选择性。

3.7 细胞色素c调控机制
ELISA检测显示ΔirpT株细胞色素c含量降低10%（P<0.01），生物信息学分析表明IrpT与DsbD蛋白（细胞色素c合成关键酶）具有高度同源性。

结论与意义
该研究首次证实irpT基因通过影响细胞色素c生物合成途径调控乳酸菌的多重胁迫响应。当irpT缺失时，电子传递链(ETC)功能受损可能触发全局应激反应，通过上调群体感应系统促进生物膜形成等适应性变化。这一发现不仅为理解乳酸菌胁迫应答提供了新视角，更为定向改造工业菌株提供了理论依据——通过调控irpT表达可同步提升菌株环境适应性和抗菌肽产量。研究团队特别指出，细胞色素c含量与胁迫抗性的负相关性为开发新型食品安全控制策略（如靶向抑制致病菌呼吸链）提供了创新思路。

值得注意的是，该研究仍存在局限性：Cre-loxP系统留下的loxP位点可能影响基因组稳定性，且质粒诱导表达系统效率有待优化。未来研究可尝试CRISPR-Cas9等新型基因编辑技术，并深入解析IrpT与DsbD蛋白的相互作用网络。这些成果为拓展乳酸菌在功能性食品和替代抗生素领域的应用奠定了重要基础。