新型高灵敏度雌激素活性报告基因细胞系的开发及其在水体监测中的应用价值

针对欧盟新规要求监测水体中极低浓度雌激素（E2、EE2、E1）的挑战，研究人员开发了基于MCF-7细胞的pNL2.3-ERE[secNluc/Hygro]报告基因检测体系。通过优化质粒浓度（5 ng/孔）、暴露时间（24 h）等参数，该检测灵敏度达E2 EC20 0.29 pM（0.08 ng/L），较现有方法提升10-100倍，且无需细胞裂解或样本预浓缩，为自动化生物传感器开发奠定基础。

　　

随着欧盟《水框架指令》修订提案将地表水中17β-雌二醇（E2）、雌酮（E1）和17α-乙炔雌二醇（EE2）的环境质量标准（EQS）分别降至0.18 ng/L、0.36 ng/L和0.017 ng/L，传统化学分析方法面临灵敏度不足的严峻挑战。这些雌激素化合物在pg/L至ng/L浓度即可对水生生物造成生殖毒性，而现有污水处理工艺难以完全去除。更棘手的是，化学分析无法检测未知污染物及其混合物效应。目前最灵敏的哺乳动物报告基因检测（如ERα-CALUX）对E2的检测限为0.19 ng/L，仍难以满足新规要求。

为解决这一技术瓶颈，瑞典农业科学大学的研究团队开发了基于分泌型纳米荧光素酶（NanoLuc）的高灵敏度雌激素受体（ER）报告基因检测系统。研究通过优化实验条件，建立了无需细胞裂解即可直接检测培养基中雌激素活性的新方法，相关成果发表于《Environment International》。

关键技术包括：1）构建含4拷贝雌激素反应元件（ERE）的pNL2.3-ERE[secNluc/Hygro]质粒；2）采用MCF-7人乳腺癌细胞系（ATCC-HTB-22）进行瞬时转染；3）通过CellTiter 96 AQueous法评估细胞活力；4）使用Spark?多模式微孔板读数仪检测NanoLuc活性。

3.1. 细胞毒性

所有测试化合物在非细胞毒性浓度下进行实验，其中非yl酚（NP）在最高浓度（33,000-100,000 nM）显示23-70%细胞活力下降，双酚A（BPA）在100,000 nM时活力降低23%。

3.2. 质粒浓度优化

比较5/10/15 ng/孔转染浓度发现，5 ng/孔在灵敏度（E2 EC₂₀ 0.25 pM）、最大fold change（4.0）、Z因子（0.6）和重复性变异系数（CVr 9%）间取得最佳平衡。

3.3. 暴露时间优化

24小时暴露兼顾灵敏度（EC₂₀ 0.39 pM）与信号强度（fold change 3.6），优于6小时（EC₂₀ 10.24 pM）或48小时（EC₂₀ 1.62 pM）。

3.4. 平板包被影响

未包被平板检测性能（EC₂₀ 0.32 pM）优于Geltrex包被板（EC₂₀ 0.45 pM），简化了实验流程。

3.5. 检测重复性

8次独立实验显示平均E2 EC₂₀为0.29±0.063 pM，CVr为22%，接近20%的可接受阈值。

3.6. 相对效应效力

EE2表现出惊人的高活性（REP 23.21），是E2的23倍，与体内数据一致；E1活性为E2的1/4（REP 0.25）。植物雌激素染料木黄酮（genistein）和大豆苷元（daidzein）活性低于E2的1/2000。

这项研究开创性地将检测灵敏度推至E2 EC₁₀ 0.009 ng/L、EE2 EC₁₀ 0.0004 ng/L，可直接监测内陆水体中EE2的EQS限值（0.017 ng/L）。其两大突破——分泌型报告基因检测和无须样本预浓缩——为开发自动化生物传感器铺平道路。特别值得注意的是，该检测首次在体外重现了EE2的高生物活性（REP>20），弥补了现有方法低估合成雌激素风险的缺陷。未来通过构建稳定转染细胞系，可进一步降低实验变异，推动该技术在水质实时监测领域的应用。