基于邻近标记技术的mRNA亚细胞定位直接检测方法及其在治疗性mRNA递送研究中的应用

本研究针对mRNA治疗面临的胞内递送效率低、内体滞留等挑战，开发了基于APEX2邻近标记与RT-qPCR联用的新技术（APEX2-RT-qPCR），通过引入生物素化spike-in RNA实现数据标准化，首次定量揭示了治疗性mRNA在内质网（ER）的高效递送规律。团队系统分析了不同信号肽（SPCS）对ER定位的影响，发现PMEL信号肽较IL6更显著促进mRNA的ER定位（p<0.05），为优化mRNA药物设计提供了新工具。该成果发表于《Molecular Therapy Nucleic Acids》，为突破mRNA疗法的亚细胞递送瓶颈提供了方法论创新。

　　

mRNA疗法的亚细胞递送之谜
在新冠疫苗成功应用的推动下，mRNA疗法已成为生物医药领域的明星技术。然而鲜为人知的是，约90%的mRNA药物在进入细胞后会被困在内体（endosome）中无法发挥作用——这就像快递包裹虽然送达了小区，却被错误地锁进了地下室仓库。更棘手的是，现有技术难以直接追踪mRNA在细胞内的"最后一公里"旅程，科学家们只能通过间接的荧光标记或蛋白质产量来推测递送效果，犹如通过仓库外的监控画面猜测包裹位置。

英国诺丁汉大学药学院的Alfredo D. Smart团队决心破解这个"黑箱"。他们注意到，内质网（ER）作为分泌蛋白和膜蛋白的合成工厂，是mRNA药物发挥功能的关键站点，但不同信号肽引导的ER靶向效率差异始终缺乏定量研究手段。受邻近标记技术APEX2可标记RNA特性的启发，团队创新性地将其与RT-qPCR结合，建立了能直接"定位追踪"mRNA的分子雷达系统。

关键技术方法
研究通过慢病毒转导构建了APEX2定位ER（APEX2-ERM）或细胞质（APEX2-NES）的HEK293T/A549细胞系，利用3'-生物素化萤火虫荧光素酶（Fluc）RNA作为spike-in优化链霉亲和素磁珠富集条件。通过APEX2介导的RNA生物素化反应，结合结构化照明显微镜（SIM）验证定位特异性，定量比较含IL6/PMEL信号肽的纳米荧光素酶（Nluc）mRNA的ER递送效率，并行检测分泌蛋白产量。

研究结果

ER与细胞质定位系统的建立
团队首先验证了APEX2-ERM与内质网标志物RCN2的共定位系数高达0.95，而APEX2-NES成功避开细胞核（与DAPI共定位系数仅0.23）。RNA斑点杂交证实两种细胞系均能有效生物素化RNA，为后续研究奠定基础。

方法学优化与验证
引入生物素化Fluc RNA作为spike-in后，团队对比三种文献报道的富集方案，最终确定的方案3使背景信号降低4个数量级（p<0.0001）。在APEX2-ERM细胞中，含IL6信号肽的mRNA（IL6-Nluc）富集效率达6倍（p<0.005），而不含信号肽的Nluc mRNA无显著富集，证明该方法对ER定位mRNA的特异性。

信号肽的调控作用
在HEK293T细胞中，PMEL信号肽较IL6使mRNA的ER富集提高1.3倍（未达显著差异），但在A549细胞中差异扩大至1.8倍（p<0.05）。有趣的是，当信号肽置于PMEL蛋白天然序列中时，PMEL mRNA产生的蛋白量显著高于IL6-PMEL mRNA（p<0.005），提示信号肽-编码区协同作用可能影响翻译效率。

研究结论与意义
该研究建立的APEX2-RT-qPCR技术首次实现了治疗性mRNA亚细胞定位的定量检测，突破了过去依赖间接指标的局限。发现PMEL信号肽具有更强的ER导向能力，为设计靶向ER的mRNA疫苗（如肿瘤抗原）提供了序列优化依据。方法学创新体现在：① 生物素化spike-in RNA实现数据标准化；② 保留mRNA天然状态避免标记干扰；③ 可拓展至其他细胞区室研究。

未来可进一步探索：① 核苷修饰（如假尿苷）对ER定位的影响；② 不同递送载体（如LNP）的亚细胞递送效率差异；③ 信号肽切割速率与翻译效率的关联。这项技术有望成为优化mRNA药物的"GPS导航系统"，推动解决制约行业发展的递送效率瓶颈。