转录调控因子GalR与LysR对Lacticaseibacillus casei TCS中双乙酰生物合成的调控机制研究

本研究针对发酵乳制品关键风味物质双乙酰（diacetyl）产量低的问题，通过DNA pull-down结合LC-MS技术筛选出调控基因alsS的转录因子GalR（A0A806E8E8）和LysR（A0A806ETL9），经EMSA和DNase I足迹实验验证其结合位点，构建基因编辑菌株证实GalR抑制而LysR激活双乙酰合成，为定向调控乳杆菌风味代谢提供了新靶点。

　　

研究背景与意义
发酵乳制品的独特风味是决定消费者选择的关键因素，其中双乙酰（diacetyl）因其浓郁的奶油香气被视为核心风味物质。目前双乙酰主要通过化学合成法生产，但消费者对天然食品添加剂的偏好促使研究者转向微生物合成途径。乳酸菌（LAB）作为传统发酵剂，其双乙酰产量受限于代谢效率，而α-乙酰乳酸合成酶（α-acetolactate synthase, ALS）编码基因alsS的表达水平是限速环节。尽管双乙酰生物合成途径已明确，但LAB中alsS的转录调控机制长期未知。

研究机构与方法
上海理工大学团队以高产双乙酰的Lacticaseibacillus casei TCS（GenBank ID: CP038153.1）为研究对象，采用DNA pull-down联合LC-MS/MS筛选alsS启动子结合蛋白，通过生物信息学预测结合位点后，使用电泳迁移率变动分析（EMSA）和DNase I足迹实验验证GalR（UniProt ID: A0A806E8E8）与LysR（UniProt ID: A0A806ETL9）的特异性结合。构建galR（NCBI gene ID: 57090079）缺失株和lysR（NCBI gene ID: 57089290）过表达株，结合RT-qPCR和发酵表型分析阐明调控机制。

研究结果

1. 转录因子筛选与结合验证
   DNA pull-down捕获的GalR和LysR经LC-MS/MS鉴定，EMSA显示二者均能结合alsS启动子。DNase I足迹精确定位GalR结合位点靠近-35区，LysR结合位点位于-10与-35区之间。

2. 调控功能解析
   表型实验表明galR缺失使双乙酰产量提升2.1倍，而lysR过表达使产量增加1.8倍。RT-qPCR证实GalR负调控、LysR正调控alsS表达，且二者结合位点空间位置决定其抑制或激活效应。

结论与意义
该研究首次揭示GalR和LysR通过差异结合alsS启动子区域调控双乙酰合成的分子机制：GalR结合-35区邻近位点阻遏转录，而LysR结合-10/-35区间位点促进转录。这一发现为通过转录工程改造乳酸菌风味代谢提供了理论依据，对开发天然风味增强型发酵乳制品具有重要应用价值。论文发表于《Food Bioscience》，获国家自然科学基金（No. 32302046、32472309）和上海市工程技术研究中心（No. 20DZ2255600）支持。