乳酸对鼠伤寒沙门氏菌浮游与生物膜细胞的亚致死损伤效应及机制研究

本研究针对食品工业中沙门氏菌通过生物膜形成和亚致死损伤逃逸消毒的难题，系统探究了乳酸(LA)对鼠伤寒沙门氏菌浮游/生物膜细胞的差异损伤机制。发现生物膜胞外聚合物(EPS)的防护作用使生物膜细胞损伤率低于浮游细胞，揭示LA通过降低胞内pH(pHi)、抑制呼吸链脱氢酶(RCD)活性及破坏膜完整性导致亚致死损伤，为优化食品消毒策略提供理论依据。

　　

在食品工业与公共卫生领域，沙门氏菌(Salmonella)始终是引发食源性疾病的主要元凶。这种革兰阴性菌不仅能通过污染禽肉、蛋制品等食物链传播，更擅长分泌胞外聚合物(EPS)形成生物膜，使其对消毒剂的抗性提升百倍。传统消毒剂如乳酸(LA)虽被美国FDA列为"公认安全"(GRAS)物质，但实践中发现其可能诱导细菌进入"假死"状态——亚致死损伤(sublethal injury)。这些损伤细胞在常规选择性培养基中无法检出，却能在营养丰富的食品环境中复活，犹如埋藏在食品安全防线中的"定时炸弹"。

安徽农业大学的研究团队在《Food Microbiology》发表的这项研究，首次系统比较了LA对鼠伤寒沙门氏菌(S. Typhimurium)浮游细胞与生物膜细胞的差异损伤效应。通过双平板计数法结合激光共聚焦显微镜(LSCM)验证，发现6 mM LA处理60分钟后，浮游细胞在肉汤和食品废水中的亚致死损伤率分别达46.3%和32.1%，显著高于生物膜细胞的28.7%和19.4%。进一步研究揭示，生物膜中EPS的"分子盔甲"作用是其防护关键——添加葡萄糖和乳清蛋白可使浮游细胞损伤率降低40%。

关键技术方法
研究采用三体系模拟场景：LB肉汤、食品加工废水和缓冲溶液。通过双平板计数(NA vs. NA+3% NaCl)量化损伤率，LSCM结合PI/cFDA荧光染色验证膜损伤。借助pH敏感染料BCECF-AM检测胞内pH(pH_i)，TTC还原法测定呼吸链脱氢酶(RCD)活性，DCFH-DA探针标记活性氧(ROS)。膜电位采用DiBAC₄(3)荧光评估，SEM观察超微结构。EPS组分通过苯酚-硫酸法和BCA试剂盒分别检测多糖与蛋白含量。

主要研究结果

1. LA对浮游与生物膜细胞的差异损伤
在食品废水体系中，生物膜细胞展现更强抵抗力：处理60分钟后存活数比浮游细胞高1.26 log CFU/mL。LSCM显示浮游细胞PI红色荧光强度是生物膜细胞的2.3倍，证实前者膜完整性受损更严重。

2. EPS组分的动态变化
LA处理导致EPS中多糖和蛋白含量分别下降37.8%和29.4%。添加1%葡萄糖可使EPS多糖含量恢复至对照组的82%，同时使损伤率降低至15.2%，证实碳源补充能增强细菌修复能力。

3. 胞内稳态失衡机制
损伤细胞胞内pH(pH_i)从7.2骤降至6.3，导致RCD活性降低68%。伴随ROS积累量达到对照组的4.2倍，引发氧化应激连锁反应。SEM观察到浮游细胞表面出现直径50-200 nm的孔洞，而生物膜细胞仅见轻微皱缩。

4. 膜系统损伤特征
膜电位检测显示浮游细胞去极化程度比生物膜细胞高53%，流式细胞术证实其膜完整性丧失细胞占比达41.7%，显著高于生物膜组的22.3%。

结论与展望
该研究首次阐明LA通过三重机制诱导亚致死损伤：①EPS耗竭削弱物理屏障；②胞内酸化(pH_i↓)抑制关键酶活性；③膜电位崩溃引发代谢瘫痪。特别值得注意的是，食品废水中的有机质可通过维持EPS合成显著降低消毒效果，这解释了为何实际生产中需要更高浓度消毒剂。研究建议未来食品消毒方案应结合EPS清除剂（如纤维素酶），并开发基于膜电位检测的快速损伤评估方法。这些发现为突破生物膜防护、精准控制"僵尸病原体"提供了全新视角，对保障冷链食品和中央厨房的安全运营具有重要指导价值。