利用气孔长度指示鳞毛蕨复合体(Dryopteridaceae)倍性水平：羽片采样位置是否影响检测结果？

本研究针对鳞毛蕨复合体(Dryopteris affinis complex)分类难题，通过流式细胞术(flow cytometry)和气孔长度测量，系统评估了羽片不同区域采样对倍性(DNA ploidy level)判定的影响。研究发现89.8%的样本可通过任意羽片区域准确推断倍性，为中欧地区蕨类植物分类提供了高效实用的形态学指标。

　　

鳞毛蕨复合体(Dryopteris affinis complex)是欧洲植物分类学家长期面临的"分类学噩梦"。这个由杂交起源、多倍化和兼性无融合生殖形成的复杂类群，包含二倍体(2x)、三倍体(3x)、四倍体(4x)和五倍体(5x)等多种倍性类型。传统形态特征难以准确区分这些细胞学上存在显著差异的类群，而染色体计数又受限于采样时机和技术难度。更棘手的是，先前研究多局限于羽片中部的初级羽片(pinna)采样，但不同研究者采用的采样标准不一，导致结果可比性存疑。

为破解这一难题，英国Edge Hill大学与捷克南波西米亚大学的研究团队在《Botanical Journal of the Linnean Society》发表论文，首次系统评估了羽片(pinnule)不同区域和叶面位置对气孔长度测量的影响。研究创新性地采用指甲油印记法(gel imprint method)，对18株代表6个分类单元的样本进行分层采样，每株测量540个气孔数据，结合流式细胞术验证，构建了迄今最全面的鳞毛蕨气孔形态数据库。

关键技术方法包括：1)采用流式细胞术以Chlorophytum comosum为内参确定DNA倍性水平；2)分级采样设计覆盖羽片远端(distal)、内侧(inner)和外侧(outer)区域以及叶面下部(lower)、中部(medial)和四分之一处(quarter)三个位置；3)使用显微镜成像系统(GX capture Olympus)标准化测量气孔保卫细胞长度；4)通过Shapiro-Wilk检验和ANOVA等统计方法分析数据异质性。

研究结果
Pinnule region
数据显示气孔长度在羽片不同区域无系统性差异（图4）。虽然42%的样本远端区域气孔最长，但三区域平均值差异不足1μm（补充表S2）。仅在D. pseudodisjuncta中发现远端与外侧区域存在显著差异(P=0.01)，但两者均值(50.14μm vs 49.25μm)仍均属三倍体范围。密度曲线（图5）进一步证实各区域分布高度重叠。

Pinna location
叶面位置影响更为显著（图6）。除D. pseudodisjuncta外，其余5个分类单元下部羽片气孔长度均与中部、四分之一处存在统计学差异。值得注意的是，五倍体D. × critica下部羽片的气孔长度甚至落入四倍体范围，暗示基部组织可能发育异常。密度分布图（图7）显示下部羽片数据离散度普遍更高。

Location of aberrant pinnule regions
在324个采样区域中，9.6%出现低于预期倍性范围的值（表2）。这些异常值集中分布于下部羽片(5.6%)，且D. cambrensis样本2024.14.11贡献了35%的异常数据。该样本采自海拔353m的无遮蔽石灰岩环境，暗示环境压力可能导致气孔发育异常。

讨论与结论
研究证实气孔长度作为倍性代理标记的可靠性：89.8%的羽片区域和92%的叶面位置能准确反映DNA倍性水平。这一发现为蕨类植物分类提供了可替代流式细胞术的简易方案，特别适合野外调查和标本馆研究。研究推荐采用叶面中部羽片近端区域作为标准采样位点，避免基部羽片的异常变异。

数据变异系数(CV)分析揭示多倍体杂交种D. × critica(8.6-8.9%)比二倍体(6.8-7.1%)具有更高变异度，支持"基因组剂量效应导致发育调控紊乱"的假说。研究还发现干燥标本与新鲜材料的气孔长度无显著差异，为标本馆材料的回溯研究提供了依据。

该研究首次建立了鳞毛蕨复合体气孔采样的标准化流程，解决了分类学实践中长期存在的采样规范问题。未来结合基因组测序数据，这套形态-细胞学整合方案将助力厘清这个著名蕨类复合体的分类学困局。正如作者Alison J. Evans强调的，在开展分子研究前明确形态分类单元，是解决复杂类群系统发育问题的关键前提。