基于互惠底物处理的合成Pseudomonas putida菌群构建及其在木质纤维素降解中的应用

本研究针对单菌株体系在复杂生物技术任务中的局限性，通过工程化改造Pseudomonas putida菌株CP-X和CP-G建立互惠共生体系，实现木质纤维素衍生的纤维二糖(cellobiose)和木二糖(xylobiose)的协同降解。研究人员创新性地采用"互惠底物处理(reciprocal substrate processing)"策略，结合数学模型预测种群动态，为合成微生物菌群(synthetic consortium)的稳定性控制提供了新思路，发表于《Synthetic Biology》。

　　

微生物在自然界中通过代谢互作形成复杂共生网络，这种协作关系使其能够完成单个菌株难以实现的复杂生物转化过程。然而在合成生物学领域，单菌株培养系统的局限性日益凸显——无论是复杂次级代谢产物的生物合成，还是木质纤维素废料的降解与增值，都需要多个菌株的协同配合。虽然微生物群落工程被视为突破这一瓶颈的潜在方案，但如何建立并维持菌株间的稳定互作关系仍是重大挑战。现有方法如群体感应(quorum sensing)回路容易产生逃逸突变株，而基于代谢互补的合成营养关系(syntrophy)虽更符合微生物进化规律，其设计原则仍需深入探索。

捷克马萨里克大学和西班牙国家生物技术中心的研究团队在《Synthetic Biology》发表研究，创新性地提出"互惠底物处理(reciprocal substrate processing)"策略，通过工程化改造两株Pseudomonas putida KT2440，使其分别专一化利用木糖(xylose)或葡萄糖(glucose)，同时表达互补的糖苷水解酶——来自Thermobifida fusca的β-葡萄糖苷酶(BglC)和β-木糖苷酶(Xyl43A)，从而建立强制性的代谢互赖关系。研究结合数学模型与实验验证，系统探索了底物组成、菌株比例和蛋白表达水平对种群动态的影响，为合成菌群的稳定性控制提供了新范式。

关键技术方法包括：1)采用Tn7转座子系统进行染色体荧光标记；2)通过I-SceI介导的同源重组进行基因组编辑；3)建立基于Logistic方程的种群动态数学模型；4)利用HPLC监测糖类代谢动态；5)引入SsrA和poly-A降解标签调控蛋白稳定性。

【菌群设计与构建】
研究团队设计了两株代谢互补的P. putida：CP-X缺失葡萄糖激酶glk但表达Escherichia coli的木糖异构酶途径(xylABE)和BglC，专一利用木糖并将纤维二糖水解为葡萄糖；CP-G则缺失葡萄糖脱氢酶gcd但表达Xyl43A，专一利用葡萄糖并将木二糖水解为木糖。这种设计通过分割碳代谢流避免了碳分解代谢抑制(CCR)，同时建立双向底物交换。值得注意的是，CP-X在木糖适应过程中发生了包含转醛缩酶tal基因的275 kb基因组区段扩增，这与先前报道的木糖适应性进化机制一致。

【酶活性与代谢特征验证】
SDS-PAGE显示BglC和Xyl43A分别占CP-X和CP-G总蛋白的12.3%和26%。静息细胞实验证实两株菌均能有效水解对应二糖，其中CP-X的纤维二糖转化速率(0.014 g/L·h)是CP-G木二糖转化速率(0.006 g/L·h)的两倍，这与胞内酶活性测定结果(BglC 1.27 U/mg vs Xyl43A 2.86 U/mg)形成有趣对比，提示木二糖转运可能是限速步骤。共培养实验显示在二糖培养基上两菌株表现出约20小时的延滞期，随后同步进入指数期，证实了代谢互赖关系的建立。

【种群动态数学模型】
研究者建立了描述菌群生长的微分方程模型，其中变量X和G分别代表CP-X和CP-G的菌体浓度(OD)，参数rm_x和rm_g为最大比生长速率，G/(C_g+G)和X/(C_x+X)表征二糖水解效率，K为培养容量。模型成功预测了底物比例调控的效果——当木二糖:纤维二糖比例为9:1时，两菌株最终生物量比可达1:1，而接种比例调整则效果有限。

【降解标签工程】
为强化代谢耦合，研究者在BglC C端添加SsrA(AANDENYALAA)、SsrActrl(AANDENYALDD)和poly-A(AAAAAA)降解标签。其中SsrA标签导致BglC完全降解，使菌群生长完全抑制；6A标签使BglC降低75%，但菌群仍偏向CP-G优势生长。通过删除N端His标签降低BglC表达(RBS强度从13,018 a.u.降至2,589 a.u.)后，菌群行为与原始版本相似，而进一步优化RBS至417 a.u.时则因BglC表达缺失导致共培养失败。

研究通过精巧的代谢工程策略，在P. putida中实现了基于互惠底物处理的合成共生关系。结果表明：1)底物比例等外在因素能有效平衡菌株生长差异，而通过糖苷水解酶表达水平等内在因素调控更具挑战性；2)CP-X承受更大代谢负担(异源途径表达+非天然底物利用)，导致菌群自然偏向CP-G优势生长；3)数学模型可准确预测底物调控效果，但需进一步整合代谢负担参数以提高预测精度。这项工作不仅为木质纤维素降解提供了新型工程菌群，更重要的是建立了"互惠底物处理"这一普适性策略，为设计稳定合成微生物生态系统提供了新思路。未来研究可探索将生产途径整合至生长较快的CP-G中，或利用模型指导更精细的基因回路设计，进一步优化菌群性能。