综述：CRISPR/Cas9介导的灵芝基因组编辑技术进展与生物技术机遇

（编辑推荐）本综述系统梳理了CRISPR/Cas9（规律间隔成簇短回文重复序列/相关核酸酶9）技术在药用真菌灵芝（Ganoderma lucidum）中的创新应用，重点解析了Cas9蛋白与向导RNA（gRNA）表达策略的优化路径，及其在靶向基因编辑和功能研究中的突破性进展，为天然产物生物合成研究提供了高效工具。

　　

Abstract

药用真菌灵芝（G. lucidum）因其产生高价值生物活性化合物的潜力成为研究热点，但传统遗传操作方法的低效性制约了其天然产物生物合成机制的解析。CRISPR/Cas9系统凭借高效、便捷的特性，为灵芝基因组编辑带来革命性突破。

CRISPR系统开发与优化

研究团队在灵芝中建立了多种Cas9核酸酶与gRNA的表达策略，包括双质粒共转染和自切割核酶（ribozyme）介导的gRNA加工系统。通过密码子优化和启动子筛选，显著提高了Cas9在灵芝菌丝体中的编辑效率，其中^Pgpd启动子驱动的Cas9表达量达到传统方法的3.2倍。

靶向基因编辑应用

该系统已成功实现灵芝基因组中多酚氧化酶（GlPPO）和三萜合成通路关键基因（GlOSC）的精准敲除，缺失突变体产量下降达67%。通过同源重组介导的基因替换技术，研究人员将外源报告基因（egfp）定点整合至灵芝染色体特定位点，整合效率达41%。

功能基因组学研究

CRISPR/Cas9技术揭示了灵芝甾醇合成通路中羊毛甾醇合酶（GlLSS）的调控网络，通过构建_GlLSS启动子突变文库，发现其受甲基转移酶（GlMT）的表观遗传调控。此外，该系统还被用于构建灵芝多糖合成酶基因（GlPS）的等位基因系列突变体。

挑战与展望

当前技术仍面临灵芝原生质体制备效率低（<35%）、非同源末端连接（NHEJ）修复占比过高等问题。未来研究将聚焦于开发基于CRISPR/dCas9的表观遗传编辑工具，以及建立灵芝孢子高效转化体系，为药用真菌合成生物学研究开辟新路径。