柠檬源细胞外囊泡作为天然药物递送平台在胶质母细胞瘤治疗中的双重作用：保护内皮完整性同时调节肿瘤微环境

本研究针对胶质母细胞瘤(GBM)治疗中血脑屏障(BBB)穿透性差和替莫唑胺(TMZ)毒性大等问题，创新性地利用柠檬(Citrus limon L.)源细胞外囊泡(PDEVs)封装TMZ(EVs@TMZ)。通过构建3D血瘤屏障(BTB)模型证实，该递送系统不仅能有效穿透BBB，保持内皮完整性，还能显著增强TMZ稳定性，在U87胶质瘤模型中展现双重疗效：选择性杀伤肿瘤细胞同时抑制VEGF-A介导的血管生成。该研究为克服GBM治疗瓶颈提供了天然纳米载体新策略。

　　

胶质母细胞瘤(GBM)作为最具侵袭性的原发性脑肿瘤，长期面临治疗困境。标准化疗药物替莫唑胺(TMZ)虽能部分穿透血脑屏障(BBB)，但存在快速降解、肿瘤分布不均和全身毒性等问题。更复杂的是，血瘤屏障(BTB)的异质性通透性和外排泵过度表达进一步限制了药物递送效率。这些生物学屏障与药物缺陷共同导致GBM患者中位生存期不足15个月，亟需开发新型递送系统。

在此背景下，研究人员创新性地将目光投向植物源细胞外囊泡(PDEVs)。这类天然纳米载体具有低免疫原性、卓越的生物相容性和跨屏障转运能力，特别是柑橘类植物来源的囊泡已被证明含有生物活性成分。前期研究还发现，柠檬(Citrus limon L.)衍生的EVs能促进组织再生并影响三阴性乳腺癌进展，但其在GBM治疗中的应用尚未探索。

为验证这一设想，研究团队通过超声法将TMZ封装入柠檬源EVs(EVs@TMZ)，并建立包含hCMEC/D3内皮细胞和3D生物打印U87胶质瘤细胞的BTB模型。采用跨内皮电阻(TEER)和FITC-葡聚糖渗透实验评估屏障完整性，结合共聚焦显微镜追踪囊泡转运。通过紫外光谱和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析药物封装效率，并利用CellTiter-Glo 3D检测系统评估治疗效果。

3.1 3D BTB模型验证EVs穿透能力
构建的双层培养系统模拟了生理性BBB和肿瘤微环境，TEER值达65 Ω·cm²证实屏障完整性。粒径分析显示EVs主要分布在100 nm，透射电镜确认其典型杯状形态。Calcein-AM标记实验证实EVs能有效被U87细胞内化，且24小时内可跨内皮层转运，为后续药物递送奠定基础。

3.2 pH依赖性TMZ稳定性
紫外光谱分析揭示TMZ在生理pH(7.4)下迅速降解，半衰期仅数小时；而在pH 5.5时稳定性显著提升。这一发现指导后续选择弱酸性条件(pH 5.5)进行药物封装，避免强酸性(pH 2.5)对生物应用的限制。

3.3 高效药物封装策略
超声辅助封装实现48.84%的包封率，Triton X-100裂解实验证实41.68%的TMZ被成功包裹。FT-IR光谱显示EVs@TMZ中TMZ的羰基峰(1700 cm^-1)位移，证实药物与囊泡脂质层的相互作用。值得注意的是，冻存一月后药物稳定性仍保持良好。

3.4 双重生物效应
在hCMEC/D3内皮细胞中，EVs@TMZ较游离TMZ显著降低ROS水平(约40%)，并促进伤口愈合。相反在U87肿瘤细胞中，80 μg/mL EVs@TMZ使ROS升高2.3倍，诱导选择性氧化应激。这种"保内皮、杀肿瘤"的双重特性凸显其靶向优势。

3.5 3D模型治疗验证
在模拟临床环境的BTB模型中，EVs@TMZ保持与游离TMZ相当的抗肿瘤效果：使U87细胞活力下降62%，迁移面积减少58%。同时显著抑制VEGF-A分泌(降幅达75%)，且不会如游离TMZ那样损害内皮屏障功能。

这项研究开创性地证明植物源EVs可作为TMZ的理想载体，其突破性体现在三方面：首先，解决TMZ稳定性难题，弱酸性封装使药物半衰期延长；其次，天然囊泡的双重调节能力既可保护正常血管，又能增强肿瘤杀伤；最后，3D BTB模型的成功应用为后续研究提供可靠工具。尽管仍需动物实验验证，该工作已为GBM治疗开辟新途径——利用可食用植物衍生的"智能"载体，实现化疗药物的精准递送。《International Journal of Pharmaceutics: X》刊发的这项成果，标志着天然纳米载体向临床转化迈出关键一步。