抗CD47抗体通过新型金属离子依赖性结合表位减少红细胞交叉连接：肿瘤免疫治疗的安全策略

为解决抗CD47抗体因靶向红细胞（RBCs）引发血凝毒性问题，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所团队开发了人源化抗体Hu1C8。该抗体通过Ca2+依赖性结合CD47近膜区独特表位，显著降低RBC交叉连接，同时保留阻断CD47/SIRPα轴（信号调节蛋白α）的肿瘤免疫活性。晶体结构解析揭示了其结合角度限制双价结合的机制，为设计低毒性CD47靶向疗法提供了新策略。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，CD47因其广泛表达于癌细胞表面并传递“别吃我”信号（don’t eat me signal）而成为热门靶点。然而，CD47同样高表达于红细胞（RBCs）和血小板，导致抗CD47抗体临床应用中面临严重血凝和贫血风险。现有抗体如Hu5F9虽能阻断CD47与SIRPα（Signal Regulatory Protein α）结合激活巨噬细胞吞噬作用，但因其结合表位易引发RBC交叉连接（cross-linking），限制了临床应用。如何平衡抗肿瘤活性和血液毒性，成为该领域亟待解决的难题。

针对这一挑战，中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的研究团队通过兔单B细胞筛选技术，开发了人源化抗体Hu1C8。该研究发表于《Journal of Biological Chemistry》，揭示了Hu1C8通过独特的Ca²⁺依赖性结合机制和表位选择，实现了高肿瘤选择性且无血凝活性的突破。

研究团队采用多项关键技术：1）兔单B细胞筛选结合人源化改造，获得低血凝活性抗体；2）表面等离子共振（BLI）和流式细胞术（FACS）评估结合特性；3）X射线晶体学解析Hu1C8 Fab-CD47胞外域（ECD）复合物结构；4）体外吞噬实验（ADCP）和NSG小鼠淋巴瘤模型验证抗肿瘤效果。

研究结果

1. 抗体开发与功能验证
   通过免疫兔记忆B细胞筛选获得原始抗体1C8，其对人及食蟹猴CD47 ECD的半数有效浓度（EC₅₀）分别为1.2 nM和1.8 nM，但对RBCs结合活性仅为Hu5F9-G4的1/10。人源化后的Hu1C8保留了亲本抗体的高亲和力（K_d=2.4 nM），且对RCC-CEM淋巴瘤细胞的吞噬促进作用与Hu5F9-G4相当（10 μg/ml时吞噬率>60%）。

2. 结构机制解析
   2.5 ?分辨率晶体结构显示，Hu1C8结合CD47 ECD的β3-β4（残基37-46）和β7-β8（97-108）区域，形成以亲水作用为主的界面（埋藏面积756 ?²）。关键发现是LCDR3的Asp97和HCDR3的Asp101通过Ca²⁺形成五角双锥配位结构，移除Ca²⁺后结合活性完全丧失（EDTA处理），补充Ca²⁺可恢复结合。

3. 血凝抑制的构象基础
   与Hu5F9平行结合CD47不同，Hu1C8以130°倾斜角结合，导致两个Fab臂空间受限。全分子模拟显示，此构象使同一抗体无法同时结合两个细胞膜上的CD47，从而避免RBC交联。而Hu5F9因结合角度垂直，易形成“Y”型交联网络。

4. 体内外疗效验证
   在Raji淋巴瘤小鼠模型中，Hu1C8（10 mg/kg）使肿瘤体积减少85%（p<0.001），疗效与Hu5F9-G4相当且无体重下降。体外实验中，Hu1C8对主动脉内皮细胞（HAECs）和肾小管上皮细胞（RPTECs）的EC₅₀较肿瘤细胞高5-10倍，显示优异的选择性。

结论与意义
该研究首次阐明抗体结合表位与血凝活性的构效关系：靶向CD47近膜区β片层且依赖Ca²⁺的倾斜结合模式，可物理性限制双价结合，从而规避RBC毒性。这一发现为设计新一代免疫检查点抑制剂提供了范式——通过表位精确定位调控抗体空间构象，既可保留Fc端效应功能（如促进巨噬细胞吞噬），又能避免非特异性细胞交联。此外，Ca²⁺依赖性结合机制的揭示，拓展了抗体多样化识别抗原的认知，为金属离子辅助的抗体工程开辟了新方向。

从转化医学角度看，Hu1C8的临床前数据表明，其差异化设计有望解决CD47靶向疗法中的血液学不良反应，推动肿瘤免疫治疗安全边界的拓展。研究团队提出的“表位-角度”双因素调控策略，亦可推广至其他易引发细胞交联的靶点（如CD40、CD20），具有广泛的药物开发指导价值。