真菌tRNA连接酶Trl1与RNA复合物的结构揭示保守的底物结合原理

本研究解析了嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum) tRNA连接酶Trl1的N端腺苷酸转移酶结构域(LIG)与RNA底物的晶体结构，揭示了Trl1在tRNA剪接和非经典HAC1 mRNA剪接过程中协调RNA外显子末端的分子机制。研究发现Trl1-LIG通过独特的C端结构域(CTD)钳制RNA并特异性识别2'-磷酸基团(2'-P)，阐明了腺苷酸转移酶超家族保守的底物结合原则，为开发抗真菌药物提供了新靶点。

　　

在真核生物中，tRNA的成熟需要经历精确的剪接过程——内含子被tRNA剪接内切酶(TSEN)切除后，外显子片段必须由tRNA连接酶重新连接。这一过程对蛋白质合成至关重要，但长期以来，连接酶如何精确识别和协调两个外显子末端的空间构象一直是个谜。更复杂的是，真菌中的三结构域连接酶Trl1还参与未折叠蛋白反应(UPR)中HAC1 mRNA的非经典剪接，其异常调控与多种疾病相关。

来自德国雷根斯堡大学等机构的研究团队在《Nature Structural & Molecular Biology》发表的研究，首次解析了嗜热毛壳菌Trl1-LIG与tRNA衍生底物的复合物结构。这项研究不仅揭示了RNA末端协调的分子机制，还发现了CTD通过精氨酸残基(R334/R337)识别2'-P的关键作用，为理解RNA修复的进化保守性提供了新视角。

研究人员主要运用了X射线晶体学(分辨率2.37?)、分子动力学模拟(MD)、电泳迁移率变动分析(EMSA)和体外环化实验等技术方法。通过比较野生型与突变体蛋白的活性差异，结合酵母遗传学验证，系统阐明了Trl1-LIG各结构域的功能分工。

Structure of CtTrl1-LIG with an activated RNA substrate
晶体结构显示，Trl1-LIG通过N端腺苷酸转移酶结构域(NTD)和C端全螺旋结构域(CTD)形成延伸的RNA结合裂隙。被腺苷酸化的5'端RNA(模拟3'外显子)与活性中心残基T146/K148/K325形成稳定相互作用，而互补链的5'外显子等效区域则通过S168/H182等残基结合在裂隙另一端。

An extended RNA-binding cleft determines RNA end coordination
分子模拟揭示CTD存在"钳制"运动，能适应不同RNA底物的空间需求。关键残基如K169/H170/S171的丙氨酸突变会导致酵母致死，证实了这个结合界面的生理重要性。EMSA实验显示，删除CTD会使RNA结合能力下降100倍。

Conserved substrate-binding mode between adenylyltransferases
与T4噬菌体Rnl2-DNA复合物的结构比对发现，尽管两者序列相似性仅22%，但腺苷酸化的5'末端都通过保守的赖氨酸(K148)和精氨酸(R99)进行协调，证实了腺苷酸转移酶超家族的共同祖先机制。

Role of the CTD during Trl1-LIG-mediated ligation
截断实验表明CTD对酶的自腺苷酸化无影响，但对AMP向RNA5'端的转移至关重要。放射性标记实验显示，ΔCTD突变体完全丧失形成AppRNA中间体的能力。

The CTD provides 2'-P specificity through conserved arginines
精氨酸突变体(R334A/R337A)对2'-P底物的连接效率显著降低，但意外发现R334A对2'-OH底物活性反而增强，暗示这两个精氨酸在稳定3'-OH攻击构象中存在功能分化。

这项研究首次在原子水平揭示了Trl1家族连接酶的底物识别机制，其发现具有多重意义：(1)阐明了CTD在RNA末端钳制和2'-P特异性识别中的双重作用；(2)建立了腺苷酸转移酶超家族从双链缺口修复到单链连接的进化联系；(3)为设计靶向真菌特异性tRNA剪接途径的抗感染药物提供了结构基础。特别值得注意的是，Trl1在真菌中不可或缺但在人类中由完全不同的机制替代，这种本质差异使其成为极具潜力的抗真菌靶点。

未来研究可进一步探索Trl1三个结构域(KIN-CPD-LIG)间的底物传递机制，以及CTD在完整tRNA分子识别中的具体作用。正如Jirka Peschek团队指出的，这些发现不仅推进了对RNA修复的基本认识，也为干预真菌感染开辟了新途径。