基于BRET技术的氯离子生物传感器Glorider开发及其在KCC2调节剂高通量筛选中的应用

本研究针对现有氯离子(Cl-)检测技术在高通量药物筛选中应用的局限性，开发了新型BRET（生物发光共振能量转移）生物传感器Glorider。通过融合氯离子敏感的E2GFP变体与NanoLuciferase，实现了活细胞内KCC2（钾-氯共转运蛋白2）调节剂的实时动力学检测，包括新型KCC2激动剂的活性表征。该技术克服了传统FRET（荧光共振能量转移）方法的背景干扰问题，为神经退行性疾病药物开发提供了高效工具。

　　

论文解读

研究背景与意义

神经元动作电位和多种生理过程依赖于氯离子(Cl^-)的跨膜运输，其浓度失衡与癫痫、自闭症和神经性疼痛等疾病密切相关。钾-氯共转运蛋白2(KCC2)是调控神经元Cl^-外流的关键靶点，其功能缺陷与Rett综合征等发育障碍相关。尽管已有基于FRET的Cl^-检测技术（如Superclomeleon），但现有方法存在pH敏感性、复杂光学系统需求和高背景干扰等问题，难以满足药物高通量筛选的需求。

研究方法与技术路线

研究人员通过融合氯离子敏感的E²GFP变体与NanoLuciferase(NLuc)，构建了膜定位的BRET生物传感器Glorider。关键技术包括：1）优化蛋白质连接顺序与接头序列以增强能量转移效率；2）使用HEK Jump-In细胞系建立可诱导KCC2表达的稳定转染模型；3）通过qPCR验证KCC2表达水平；4）采用384孔板格式结合Pherastar酶标仪实现动态BRET信号检测；5）利用细胞外NLuc抑制剂消除裂解细胞信号干扰。

研究结果

设计并表征Glorider生物传感器
通过将E²GFP与NLuc以"Luphin"优化构象连接，BRET信号动态范围提升至5.1倍，氯离子抑制曲线IC₅₀为37.6±1.4 mM（图1）。对照实验证实NLuc活性不受渗透压影响（图2）。

活细胞氯离子动态监测
在低剂量多西环素（0.08 ng/mL）诱导的KCC2表达模型中，基础Cl^-浓度从野生型的40.5±6.9 mM降至17.7±1.8 mM（p=0.0036）（图3C）。WNK激酶抑制剂WNK463（EC₅₀=129 nM）和NKCC1阻断剂布美他尼（EC₅₀=100 nM）均能显著降低细胞内Cl^-（图3D-G）。

KCC2调节剂药效评价
KCC2拮抗剂VU0463271可剂量依赖性升高Cl^-至40 mM（图4A），而专利化合物12（EC₅₀=1.74 μM）能重现Thallium法检测的激动活性（图4B-C）。

研究结论与讨论

Glorider传感器通过BRET技术实现了FRET方法5倍的信号动态范围提升，其独特的优势包括：1）NLuc激发特异性减少背景干扰；2）细胞外抑制剂消除裂解细胞信号；3）兼容常规酶标仪的高通量筛选。研究证实低表达KCC2模型能更好模拟疾病状态，为开发神经精神疾病药物提供了新工具。未来可通过改造亚细胞定位（如内质网靶向）或结合GlyR激活模型进一步优化检测灵敏度。该成果发表于《SLAS Discovery》，为氯离子调控研究提供了从基础科研到药物开发的桥梁性技术平台。