酵母展示技术筛选大环肽库：实现选择过程可控与亲和力分级的新策略

研究人员针对现有大环肽筛选技术（如噬菌体展示和mRNA展示）存在的选择过程不可控、耗时耗力等问题，开发了基于酵母展示的定量流式细胞术筛选策略。该研究成功构建了结构多样的二硫键环化肽库，筛选出对五种不同蛋白靶点（PT1-PT5）具有纳摩尔级亲和力的特异性配体，并通过X射线晶体学揭示了配体-靶标复合物的精细相互作用模式。这项发表于《Nature Communications》的研究为快速发现基因编码的大环肽配体提供了简便、定量且经济高效的新方法。

　　

大环肽作为连接小分子药物与生物大分子（如抗体）的重要桥梁，近年来在药物开发领域展现出巨大潜力。目前已有约80种肽类药物获批上市，其中40余种为大环肽结构。这类分子兼具高亲和力、良好蛋白水解稳定性和潜在膜通透性等优势，但其发现过程仍面临重大挑战。传统技术如噬菌体展示和mRNA展示虽能生成庞大肽库，但存在选择过程"黑箱"操作、无法实时监控、后期验证耗时等固有缺陷。更关键的是，这些技术难以对单个克隆或群体在筛选过程中的表现进行定量评估，导致筛选效率低下且结果不可预测。

针对这些技术瓶颈，来自瑞士洛桑联邦理工学院等机构的研究团队在《Nature Communications》发表了创新性解决方案。研究人员巧妙地将酵母展示技术与定量流式细胞术相结合，开发出能够实时监控数百万个大环肽分子筛选过程的平台。该系统不仅能精确控制选择压力，还可实现亲和力分级，最终成功鉴定出针对五种不同蛋白靶点的高质量配体。X射线晶体学分析进一步揭示了配体与靶标间完美的形状互补性和广泛的表面相互作用，从结构层面解释了其卓越的亲和力和选择性。

研究团队采用了多项关键技术：1）构建基于半胱氨酸的"单环"（CX_mC）和"双环"（CX_mCX_nC）拓扑结构的大环肽酵母展示文库；2）开发无半胱氨酸的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白表达系统；3）结合磁珠分选与多轮荧光激活细胞分选（FACS）的筛选策略；4）运用下一代测序（NGS）分析筛选群体；5）通过酵母表面滴定和表面等离子共振（SPR）测定结合亲和力；6）采用X射线晶体学解析配体-靶标复合物结构。

【酵母展示大环肽文库的构建】研究团队设计了五种不同拓扑结构的文库，包含2-3个固定半胱氨酸位点和7-12个随机氨基酸。通过使用"NNK"密码子，每个随机位置出现半胱氨酸的概率约为3%。关键创新在于采用无半胱氨酸的GPI锚定蛋白，避免了肽与载体蛋白间的二硫键错配。NGS分析证实文库具有预期的半胱氨酸分布和氨基酸频率，可形成多达70种不同的"双环"拓扑结构。

【多靶点筛选与配体鉴定】针对五种结构功能各异的蛋白靶点（醛缩酶PT1、链霉亲和素PT2、碳青霉烯酶GES-5 PT3、碳酸酐酶PT4和α-糜蛋白酶PT5），研究采用磁珠预富集结合四轮FACS的策略。通过交替使用不同检测试剂，有效避免了检测试剂结合肽的富集。测序分析发现13种独特的大环肽配体，包括含"HPQ"基序的链霉亲和素结合肽和含"GPYY"基序的碳酸酐酶结合肽。值得注意的是，不同靶点偏好不同拓扑结构：PT1和PT4倾向于"单环"肽，而PT5更易被"双环"肽识别。

【结合特性与特异性分析】酵母表面滴定显示，多数配体的表观解离常数（K_D^app）在纳摩尔范围（0.2 nM-1 μM）。特别地，针对PT5的"双环"肽MP5.4.3抑制常数（K_i）达360 pM。SPR验证了酵母表面测定的可靠性，同时揭示了不同二硫键异构体的亲和力差异。竞争实验证实配体具有高度特异性，如MP5.4.3对人中性粒细胞弹性蛋白酶等同源蛋白酶的选择性超过100,000倍。

【结构基础与作用机制】X射线晶体学（2.42 ?）解析了MP5.4.3与α-糜蛋白酶的复合物结构（PDB: 9F6H）。该"双环"肽通过784 ?²的接触面与酶活性中心结合，形成63个分子间相互作用。其中色氨酸4（Trp4）占据S1疏水口袋，精氨酸7（Arg7）与Asp64形成盐桥。值得注意的是，37个相互作用涉及肽主链原子，解释了其高亲和力的结构基础。虽然晶体中肽保持完整，但溶液实验显示其可被蛋白酶切割，呈现类底物结合模式。

这项研究的重要意义在于：1）建立了酵母展示筛选大环肽的通用平台，解决了现有技术选择过程不可控的核心问题；2）证明了即使使用相对较小的文库（~10⁹），也能获得纳摩尔级亲和力的配体；3）结构分析为理性设计提供了模板；4）GPI锚定系统可推广至其他酵母菌株，增强技术灵活性。与噬菌体展示相比，酵母展示筛选的7肽"单环"配体亲和力平均提高10倍，展现了技术优势。该平台还可与化学修饰、合理设计等策略结合，进一步拓展大环肽的药物开发潜力。