致病性大肠杆菌多功能毒力因子Lymphostatin的高分辨率结构解析揭示其抑制淋巴细胞活性的分子机制

本研究针对致病性大肠杆菌(EPEC/EHEC)关键毒力因子Lymphostatin(LifA)的结构与功能开展突破性研究。通过冷冻电镜技术在不同pH条件下解析了这种366 kDa多功能蛋白的三种构象，首次揭示其包含两个糖基转移酶(GT)结构域、一个蛋白酶结构域和新型ART结构域的复杂架构，阐明了其通过构象变化调控活性的分子机制。该研究为理解A/E型细菌的肠道定植和免疫逃逸提供了重要结构基础，发表于《Nature Communications》。

　　

致病性大肠杆菌一直是全球儿童腹泻和致命性感染的重要病原体，其中肠致病型(EPEC)和肠出血型(EHEC)尤为凶险。这些细菌通过" attaching and effacing"(A/E)机制破坏肠上皮细胞，而其分泌的淋巴抑制素(Lymphostatin/LifA)更被认为是抑制宿主免疫防御的"秘密武器"。这种366 kDa的巨型蛋白能以前所未有的效力(femtomolar级)阻断淋巴细胞增殖，导致细胞周期停滞而非直接杀伤，但长期以来科学家对其作用机制知之甚少。更令人困惑的是，LifA既参与细菌粘附又调控免疫反应，这种"一专多能"的特性背后隐藏着怎样的分子密码？

由德国维尔茨堡大学Bettina B?ttcher团队联合英国罗斯林研究所等机构开展的本研究，首次通过冷冻电镜技术解析了LifA的三维结构，揭开了这个"分子多面手"的神秘面纱。研究发现LifA具有令人惊叹的复杂架构——不仅包含预测的糖基转移酶(GT)和蛋白酶结构域，还意外发现了第二个GT结构域和一个功能未知的ADP-核糖基转移酶(ART)结构域。这些发现发表于《Nature Communications》，为理解A/E病原体的致病机制提供了全新视角。

研究人员采用冷冻电镜(cryo-EM)在不同pH条件下解析结构，结合热迁移实验优化蛋白稳定性，通过细胞实验验证功能。使用HEK293T细胞和牛T淋巴细胞模型，结合荧光标记和共聚焦显微镜观察内化过程。通过点突变和体外酶活实验验证关键催化位点功能。

LifA是三种构象共存的多结构域蛋白
通过pH调控的冷冻电镜分析，发现LifA存在三种构象：在酸性pH(pH4.0)下以构象I为主，中性pH(pH6.5)下构象II占优，碱性条件(pH8.0)下出现延伸的构象III。这种pH依赖性构象变化暗示其在穿越内体时的成熟机制。

LifA具有两个糖基转移酶结构域
结构分析首次发现LifA含有两个GT结构域：GT-I具有典型DXD基序但活性位点被连接肽(L-I)阻塞；GT-II虽具有GT折叠但缺乏功能性DXD基序，提示其可能参与底物识别而非催化。

蛋白酶结构域活性位点不可及
保守的催化三联体(C1480-H1581-D1596)被交叉螺旋和功能环物理阻挡，连接肽L-II虽靠近活性位点但被氢键网络固定。这种"双保险"设计确保蛋白酶在运输过程中保持失活状态。

顶点结构域作为构象切换中枢
由两个亚基组成的顶点结构域通过pH敏感相互作用网络连接不同结构域。其N端亚基形成分子"万能插座"，在三种构象中分别与不同伙伴相互作用，包括π-阳离子相互作用(H1448-R2628)在碱性条件下的特异性稳定作用。

ART结构域具有破坏的催化中心
虽然结构预测显示ART结构域具有R-T-E催化基序，但精氨酸侧链方向异常且NAD⁺结合位点被C端占据。体外实验证实其缺乏ADP-核糖基化活性，可能演变为蛋白质相互作用平台。

LifA-Cy3B在细胞膜成簇并被内化
荧光标记实验显示LifA能在T淋巴细胞和HEK293T细胞膜形成稳定簇状结构，随后通过内化进入细胞。这种内化过程与膜标记物WGA633共定位，符合受体介导的内吞机制。

这项研究首次完整揭示了LifA的复杂结构蓝图，阐明了其作为"分子瑞士军刀"的多功能基础。特别值得注意的是，研究发现了LifA与典型大分子梭菌毒素(LCTs)的关键差异：除了共享的GT-I和蛋白酶结构域外，LifA还具有独特的GT-II和ART结构域，这种结构创新可能反映了A/E病原体在宿主适应过程中的进化策略。

研究提出的"双GT结构域"模型为理解LifA的超强免疫抑制活性提供了新线索——两个GT结构域可能通过协同作用放大对宿主信号通路的干扰。而pH敏感的构象切换机制则解释了为何LifA需要在酸性内体环境中才能释放其毒性效应。这些发现不仅为开发针对EPEC/EHEC的新型抗感染策略提供了精确的分子靶点，也为理解细菌毒素的进化多样性提供了重要案例。

特别值得关注的是，尽管ART结构域在演化过程中失去了催化活性，但其在构象重排中的动态行为暗示它可能作为"分子传感器"参与宿主识别。这种功能转换现象为理解细菌效应蛋白的适应性进化提供了生动例证。未来研究若能鉴定出LifA的宿主受体和蛋白酶激活因子，将有望开辟抗毒力治疗的新途径。