代谢工程改造解脂耶氏酵母通过组合策略实现β-榄香烯的高效生物合成

本研究针对传统植物提取法生产β-榄香烯(β-elemene)存在的高成本与环境负担问题，通过代谢工程改造解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，组合优化甲羟戊酸(MVA)途径、扩增ermacrene A合成酶(GAS)拷贝数、强化β-氧化途径及引入异戊烯醇利用途径(IUP)，最终使摇瓶发酵产量提升3.5倍至3.08±0.05 g/L，为高价值倍半萜的可持续生产提供了新策略。

　　

β-榄香烯是从传统中药温郁金中提取的具有广谱抗肿瘤和抗炎活性的倍半萜化合物，目前其商业化生产主要依赖植物提取，但该方法成本高、环境负担重且难以规模化。随着合成生物学的发展，利用微生物细胞工厂实现β-榄香烯的生物合成成为研究热点。然而，微生物缺乏直接合成β-榄香烯的途径，需通过前体Germacrene A经热诱导Cope重排转化获得，这成为制约产量的关键瓶颈。

针对这一挑战，来自华东理工大学等机构的研究团队选择解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)作为生产宿主。这种被FDA认证为GRAS（一般认为安全）的产油酵母，拥有活跃的三羧酸循环(TCA)和强大的内源性甲羟戊酸(MVA)途径，能高效生成倍半萜合成关键前体法尼基焦磷酸(FPP)，其特有的脂滴结构还可作为亲脂性化合物的储存库。研究人员通过组合代谢策略对Y. lipolytica进行系统改造，相关成果发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》。

研究采用CRISPR-Cas9基因编辑、多拷贝整合、异源途径引入等关键技术，构建了包含12个工程菌株的改造体系。通过增强MVA途径关键酶表达、优化Germacrene A合成酶拷贝数、强化乙酰辅酶A(acetyl-CoA)供应及引入异戊烯醇利用途径(IUP)，逐步提升代谢通量。

3.1 增强MVA途径碳流量
在底盘菌株Po1f-tHEI2L基础上，过表达ERG19（甲羟戊酸二磷酸脱羧酶）、ERG13（羟甲基戊二酰辅酶A合酶）使β-榄香烯产量提升13-18%。将ERG12（甲羟戊酸激酶）和ERG8（磷酸甲羟戊酸激酶）整合至XPR2位点后，菌株yl-elem05产量达1.68±0.19 g/L，较亲本提高92.8%，证实ERG系列酶是除HMG1外新的代谢瓶颈。

3.2 优化Germacrene A合成酶拷贝数
采用来自Daldinia loculate的dlGAS酶，通过多拷贝整合策略构建yl-elem06至yl-elem09菌株。当拷贝数增至3个时产量达2.82±0.04 g/L，但继续增加会因代谢负担导致生长抑制，说明存在表达上限。

3.3 强化乙酰辅酶A供应
测试三种乙酰辅酶A生成途径：过表达β-氧化相关基因POT1（3-氧酰基硫解酶）使产量达3.00±0.05 g/L；引入异源PHK途径（磷酸酮醇酶/磷酸转乙酰酶）效果有限；而SeACS^L641P（乙酰辅酶A合成酶突变体）使产量提升至2.96±0.06 g/L，显示β-氧化途径对增产最有效。

3.4 引入IUP途径
在yl-elem09中引入酿酒酵母胆碱激酶(ScCK)和拟南芥异戊烯基磷酸激酶(AtIPK)构成的IUP途径，以异戊烯醇为底物快速生成IPP。添加10 mmol/L异戊烯醇使最终产量达3.08±0.05 g/L，但高浓度会因IPP积累产生细胞毒性。

该研究通过系统代谢工程改造，使β-榄香烯产量达到目前报道的酵母体系最高水平（3.08 g/L），葡萄糖转化率达51.27±0.75 mg/g。研究不仅证实Y. lipolytica作为倍半萜生产平台的优越性，还揭示ERG系列酶、β-氧化衍生乙酰辅酶A等新调控靶点，为其他高价值萜类化合物的生物制造提供了范式。特别是IUP途径与传统MVA途径的协同作用，为突破萜类合成代谢瓶颈提供了新思路。这种微生物合成策略有望替代传统植物提取方法，实现β-榄香烯的绿色可持续生产。