基于分子动力学模拟指导的RNA结合蛋白PARCL液-液相分离调控研究

本研究通过粗粒化分子动力学(MD)模拟揭示了植物特异性RNA结合蛋白PARCL的液-液相分离(LLPS)驱动机制。研究人员构建了HPS-Urry模型模拟PARCL的相分离行为，通过接触频率分析鉴定出酪氨酸残基为关键驱动因子，并设计突变体PARCLPLD Y-E验证了模拟预测。实验证实该突变可破坏体外和体内 condensate 形成，同时发现miRNA结合区域与相分离区域相互独立。该研究为生物分子凝聚体的靶向工程提供了新范式。

　　

生物分子凝聚体作为无膜细胞器，在RNA转运、应激反应等生命过程中发挥关键作用。其中液-液相分离(LLPS)现象近年来备受关注，但植物RNA结合蛋白的相分离调控机制仍存在知识空白。Phloem-Associated RNA-Chaperone-Like(PARCL)蛋白是植物韧皮部特异性RNA结合蛋白，能形成动态的凝聚体，可能参与长距离RNA运输。然而，驱动PARCL相分离的分子机制及其与RNA互作的关联尚不明确，这限制了人们对该蛋白功能的深入理解和应用开发。

为解决这一科学问题，英国John Innes Centre与德国汉堡大学的研究团队在《iScience》发表联合研究成果。研究采用粗粒化分子动力学(MD)模拟结合实验验证的策略，通过GENESIS软件构建HPS-Urry模型模拟PARCL相分离行为，利用接触图谱分析鉴定关键残基，并设计靶向突变体进行功能验证。同时整合体外相分离实验、烟草叶片体内观察以及miRNA结合研究，系统解析了PARCL相分离的分子机制。

关键技术方法包括：1) 采用HPS-Urry粗粒化模型进行分子动力学模拟；2) 基于AlphaFold2和IUPred3预测蛋白结构域；3) 通过接触频率分析鉴定关键相互作用残基；4) 构建PARCL突变体进行体外相分离实验；5) 烟草叶片瞬时表达系统观察体内凝聚体形成。

Phase separation of eYFP-PARCL can be attributed to PARCL
通过对比eYFP、PARCL单独及混合系统的模拟与实验，证实PARCL自身足以驱动相分离。粗粒化模拟显示PARCL形成典型液滴(图2B)，而eYFP均匀分布(图2A)。实验验证eYFP-PARCL在10% PEG3350条件下形成凝聚体，而游离eYFP无此现象(图2D)，体内实验也观察到类似现象(图2F-G)。

Contact dynamics from MD simulations can be used to predict key condensate-inducing residues
接触分析揭示PARCL中酪氨酸残基构成相互作用网络(图3)，特别是PLD结构域中的6个酪氨酸(Y)接触频率最高。动态分析显示99.7%的接触在100皮秒内解离，符合液体特性。网络拓扑分析表明这些酪氨酸与邻近亮氨酸形成多价相互作用枢纽(图S4)。

Targeted engineering of PARCL validates the predicted phase separation behavior
将PLD区6个酪氨酸突变为谷氨酸(E)构建PARCL_{PLD Y-E}突变体。模拟显示该突变显著破坏相分离(图4B)，实验证实其体外凝聚体形成能力减弱(图6C)，体内表达也显示类似表型(图6D)。

Alternate tyrosine mutations show importance of residue selection
系统评估不同酪氨酸组合突变的影响，发现相分离破坏程度与突变位点选择密切相关(图5)。PARCL_{PLD Y-E}的破坏效应仅次于全酪氨酸突变体，表明PLD区酪氨酸的协同作用。

PARCL-miRNA interactions are independent of phase separation drivers
模拟发现miR399主要与PARCL C端富含K/R/H的区域结合(图6)，实验证实PARCL_{C-term S-E}突变体虽保持相分离能力，但miRNA结合显著减弱。密度分布图显示野生型PARCL有效招募miRNA进入凝聚体，而突变体中miRNA多滞留于溶剂相(图8)。

该研究通过多尺度模拟与实验验证，首次系统阐明了PARCL相分离的分子机制：1) PLD区酪氨酸网络通过π-π等多价相互作用驱动相分离；2) C端碱性区域独立介导miRNA结合；3) 相分离与RNA结合功能可被分别调控。这一发现不仅深化了对植物RNA转运机制的理解，更重要的是建立了"模拟指导-靶向设计-功能验证"的研究范式。通过粗粒化模型成功预测关键残基并指导蛋白质工程，为理性设计生物分子凝聚体提供了新思路。研究揭示的相分离与RNA结合功能模块的独立性，也为开发模块化调控工具奠定基础。未来可进一步探索该策略在合成生物学中的应用，如设计人工RNA转运系统或调控植物逆境响应。