TAS-seq技术实现亚细胞单链腺苷图谱分析：信号肽辅助腺苷脱氨的新方法

《Cell Reports Methods》：TAS-seq enables subcellular single-stranded adenosine profiling by signal peptide-assisted adenosine deamination

本研究针对RNA结构动态变化与单细胞异质性研究的瓶颈问题，开发了TAS-seq（TadA-8e脱氨酶辅助亚细胞结构腺苷测序）技术。通过将工程化脱氨酶TadA-8e靶向亚细胞区室，实现了对RNA单链腺苷（ssA）特别是发夹环结构的原位标记。该技术成功解析了核、胞质和内质网膜中RNA结构的区室特异性差异，揭示了RNA稳定性与结构的关联性，并应用于CRISPR-Cas13d系统gRNA优化。研究成果为RNA结构动态研究提供了新工具，发表于《Cell Reports Methods》。

RNA分子在生命活动中扮演着关键角色，其功能不仅取决于序列信息，更与动态变化的二级结构密切相关。传统RNA结构研究方法面临诸多挑战：化学标记法难以区分特定亚结构，区室分离技术无法获取完整RNA信息，单细胞水平研究更是空白。这些限制严重阻碍了对RNA生命周期中结构动态变化的理解，特别是在不同亚细胞区室中的结构重塑过程。

西湖大学的研究团队在《Cell Reports Methods》发表创新性研究，开发了TAS-seq技术。该技术通过信号肽引导工程化脱氨酶TadA-8e靶向特定亚细胞区室（细胞核、胞质和内质网膜），利用酶促反应标记单链腺苷，实现了全转录组水平的RNA结构动态分析。研究发现TAS-seq对"UA"序列和发夹环结构具有特异性识别能力，揭示了RNA结构在不同区室的动态变化规律，并成功应用于单细胞RNA结构异质性研究和CRISPR-Cas13d系统gRNA优化。

关键技术方法包括：1）构建靶向不同亚细胞区室（含核定位信号NLS、核输出信号NES和内质网膜定位信号ERM）的TadA-8e表达系统；2）利用HEK293T和K562细胞系进行体内外修饰实验；3）结合高通量测序和生物信息学分析鉴定A-to-G编辑位点；4）单细胞TAS-seq（scTAS-seq）分析技术；5）RNA结构预测与功能验证实验。

研究结果部分：
"Development and performance of TAS-seq for transcriptome-wide RNA profiling"显示，TAS-seq在三个亚细胞区室鉴定出37-90万个修饰位点，覆盖约9000-10000个基因，突变率（RMR）与测序深度无关，且主要富集在"UA"序列背景的单链区域。

"TAS-seq's structural preference for single-stranded adenosine"证实该方法对单链腺苷（特别是发夹环结构）具有高度特异性。实验显示7-10nt环长、3-5bp螺旋长度的发夹结构最易被修饰，这与TadA-8e进化起源（识别tRNA^Arg反密码环）的结构特征一致。

"TAS-seq can profile subcellular RNA"部分通过比较APEX-seq等数据，证明该方法核RNA定位特异性达92%，且能检测到XIST lncRNA等区室特异性RNA的结构特征。定量分析发现核RNA比胞质RNA更易被修饰，提示其结构松散程度更高。

"TAS-seq contributes to the study of structure-related cell events"揭示RNA结构稳定性存在区室差异：胞质和ERM中结构紧密的RNA半衰期较短，且CDS区的结构-稳定性相关性最强。研究还发现4.7%-13%的修饰位点存在区室间差异，这些差异位点主要富集在UTR区域，与RNA加工和翻译调控相关。

"TAS-seq facilitates the selection of gRNA in the CRISPR-Cas13d system"证明该方法可优化gRNA设计。数据显示靶向TAS-seq标记位点（特别是种子区15-21nt）的gRNA活性显著提高，且优于SHAPE和DMS方法的预测效果。

"scTAS-seq at the single-cell level"实现了单细胞水平胞质RNA结构异质性分析。研究发现基础代谢相关RNA结构保守（如28S rRNA），而调控网络相关RNA（如BUB3 mRNA）呈现显著结构异质性，提示RNA结构变异可能参与细胞功能特化调控。

结论部分指出，TAS-seq技术通过整合酶促标记与亚细胞定位策略，突破了传统RNA结构研究方法的局限。该技术不仅能解析RNA结构动态与功能的关系，还为CRISPR-Cas13d系统优化提供了新思路。未来通过启动子调控和蛋白质工程改造，可进一步拓展其在生理条件研究和多核苷酸识别等方面的应用前景。研究也存在一定局限，如仅针对腺苷修饰、存在序列偏好性等，这些为技术改进指明了方向。