基于AlphaFold2的Shaker Kv通道闭合态模型揭示电压门控机制与4-氨基吡啶抑制新靶点

电压门控钾通道(Kv1)的闭合态结构长期缺失，阻碍了对电压传感域(VSD)驱动孔道域(PD)开放的分子机制理解。芝加哥大学Bernardo I Pinto-Anwandter团队通过AlphaFold2构象采样技术，首次构建了Shaker Kv通道的闭合态模型(R4down)，揭示了S4-S5连接子与S5螺旋间氢键断裂是激活通路的关键步骤，并鉴定出4-氨基吡啶(4-AP)在闭合态的特异性结合腔。该研究为神经退行性疾病药物设计提供了新靶点，发表于《Biophysical Journal》。

　　

神经元电信号传导的核心在于电压门控钾通道的精密调控，其中Shaker家族(Kv1)通过电压传感域(VSD)的构象变化驱动孔道开放，实现动作电位复极化。然而数十年来，闭合态结构的缺失使得两个关键科学问题悬而未决：VSD如何通过机械力传递控制孔道开合？临床药物4-氨基吡啶(4-AP)为何能选择性稳定闭合态？芝加哥大学的研究团队在《Biophysical Journal》发表的研究，通过创新性整合人工智能预测与实验验证，为这些机制谜题提供了分子层面的解答。

研究团队采用AlphaFold2的MSA子采样技术，对果蝇Shaker通道进行构象空间探索。通过分析6000个VSD模型，筛选出R4精氨酸未完成外移的"R4down"构象作为闭合态模板。基于此构建的闭合态全通道模型显示：S4-S5连接子与S5螺旋间的M393氢键网络是关键的机械耦合枢纽，其断裂会显著改变电压依赖性激活曲线。电生理实验证实，破坏该氢键的M393P突变使半数激活电压左移30 mV，并能逆转ILT突变对最后电荷转移步骤的阻滞效应。

研究通过四个关键发现系统阐释了门控机制：1）闭合态模型显示S6螺旋通过旋转平移收缩孔道，I470残基处形成1.5 ?的物理屏障；2）S4-S5连接子如同"分子杠杆"，其向下位移带动S6末端发生9 ?的径向收缩；3）4-AP结合腔由S5(L399/I400/L403)与S6(V467/L468等)构成，分子动力学模拟显示该腔体在闭合态才稳定存在；4）突变结合腔关键残基(L399A/V467I)可使4-AP抑制效力改变100倍，证实了预测位点的功能性。

主要技术方法包括：1）AlphaFold2多序列比对(MSA)子采样构象预测；2）基于HOLE算法的孔道半径分析；3）非洲爪蟾卵母细胞电压钳记录；4）AutoDock Vina分子对接与CHARMM36m力场分子动力学模拟。

研究结果部分：
"电压传感域的构象采样"揭示AlphaFold2通过调整MSA子采样参数(16:32)可稳定捕获R4位于F290下方的VSD构象，该状态与开放态相比S4发生6 ?内移。
"闭合态Shaker通道模型"显示采用R4down模板构建的模型孔道面积(40 ?²)仅为开放态(150 ?²)的27%，且S6末端形成疏水密封。
"S4-S5连接子运动机制"通过突变实验证明M393氢键网络决定最后电荷转移步骤，ILT-M393P双突变能完全恢复被阻滞的电压传感激活。
"4-氨基吡啶结合位点鉴定"发现该药物通过结合S5-S6界面疏水腔(解离常数170 μM)实现状态依赖性抑制，L399A突变使IC₅₀降至32 μM。

这项研究首次在原子尺度描绘了Kv通道从闭合到开放的动态过程，提出"氢键断裂-杠杆位移-螺旋旋转"的三步激活机制。其重要意义在于：1）为理解电压门控离子通道的变构耦合提供普适性框架；2）阐明4-AP通过"闭合态捕获"发挥治疗多发性硬化症作用的分子基础；3）发展的MSA子采样策略为膜蛋白动态研究开辟新途径。该成果不仅解决了领域内长期存在的机制争议，更为靶向神经通道疾病的药物设计提供了精确的结构模板。