DNA-PKcs/JNK/p53通路调控DNA复制灾难中细胞命运向死亡的转变机制研究

本研究针对癌症治疗中DNA复制压力引发的细胞衰老问题，揭示了通过DNA-PKcs/JNK/p53信号轴调控细胞命运决定的新机制。研究人员通过急性复制体功能障碍结合ATR抑制，发现该策略能触发不可逆的复制叉崩溃（DNA replication catastrophe），将衰老细胞导向死亡。关键发现包括：JNK通过增强p53依赖性凋亡程序并诱导γH2AX全核分布形成正反馈循环；DNA-PKcs通过MRE11和PARP1识别ssDNA缺口启动信号级联反应。该研究为克服治疗诱导衰老（TIS）提供了新的靶向策略，对提高抗癌疗法疗效具有重要意义。

　　

在癌症治疗领域，DNA复制压力既是肿瘤细胞的致命弱点，也是治疗抵抗的根源。传统化疗药物常因诱发治疗诱导衰老（therapy-induced senescence, TIS）而疗效受限——这些"僵尸细胞"不仅能存活下来，还会通过衰老相关分泌表型（SASP）重塑肿瘤微环境，甚至促进转移。更棘手的是，ATR抑制剂（ATRi）和PARP抑制剂（PARPi）等靶向复制压力的药物同样面临TIS的困扰。那么，是否存在某种分子开关，能将细胞命运从衰老转向死亡？这正是纽约州立大学石溪分校Hyungjin Kim团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究要解决的核心问题。

研究人员创新性地采用急性复制体功能障碍（通过诱导降解关键组分TIM）结合ATR抑制的策略，成功触发DNA复制灾难——一种由过量单链DNA（ssDNA）积累导致的不可逆复制叉崩溃。这项研究揭示了DNA-PKcs/JNK/p53信号轴如何通过多层次调控改变细胞命运决定，为克服TIS提供了全新视角。关键技术方法包括：RNA测序分析转录组变化、DNA纤维实验检测ssDNA缺口、免疫荧光追踪γH2AX全核分布、流式细胞术定量凋亡和衰老标志物，以及利用CRISPR构建的基因敲除细胞模型验证关键靶点。

【DNA-PKcs和CHK1依赖性p53激活是DNA复制灾难中细胞死亡的原因】
研究发现，TIM降解联合ATR抑制可协同诱导pRPA32 S4/S8和γH2AX显著升高，导致细胞凋亡。通过免疫荧光观察到γH2AX呈现特征性的全核分布模式，这种分布依赖于DNA-PKcs和CHK1活性。碱性彗星实验证实DNA断裂增加，而mirin（MRE11核酸酶抑制剂）可抑制该现象，提示MRE11介导的异常复制叉处理是复制灾难的关键起始事件。值得注意的是，p53在S15位点的磷酸化迅速响应DNA损伤，且DNA-PKcs或CHK1抑制能阻断该磷酸化及下游PUMA（p53促凋亡靶基因）的表达，表明p53处于DNA-PKcs/CHK1信号通路下游。

【急性复制体功能障碍通过调节促凋亡和抗凋亡蛋白平衡使衰老细胞转向死亡】
比较研究发现，ATRi或PARPi单药主要诱导p21介导的衰老，而TIM降解联合ATR抑制则通过更强效的p53激活压倒衰老程序。实时凋亡监测显示，联合处理16小时即出现显著细胞死亡。转录组分析揭示，复制灾难特异性上调p53靶基因（如p53INP1、PIG3），同时下调DNA修复相关基因。特别重要的是，PARPi诱导抗凋亡蛋白BCL-XL表达，而联合处理则通过CHK1依赖性机制选择性激活PUMA，突破凋亡阈值。

【DNA复制灾难导致与细胞死亡相关的转录组大规模改变】
RNA测序显示，5-Ph-IAA/ATRi联合处理引发转录组剧变：p53通路、促炎信号和凋亡信号显著上调，而DNA复制和修复通路被抑制。关键差异表达基因中，TP53INP1、TP53I3/PIG3等p53靶基因上调，CMG复合体亚基和FANC基因家族成员下调。这些变化构成促凋亡的分子环境，其中PIG3表达上调超过20倍，后续实验证实其通过放大DNA-PKcs信号促进复制灾难。

【JNK增强DNA复制灾难中p53依赖性凋亡程序】
JNK抑制可像DNA-PKcs或CHK1抑制一样有效阻止γH2AX全核分布和凋亡。机制上，JNK通过双重作用促进细胞死亡：一方面通过S6磷酸化增强p53转录活性，另一方面促进HIPK2-p53INP1复合物形成，后者催化p53 S46磷酸化——该位点与凋亡程序特异性相关。PIG3作为p53靶基因，其缺失会减弱DNA-PKcs激活和下游信号，形成正反馈环路。此外，JNK还通过p53AIP1（一种线粒体膜电位调节蛋白）促进ROS产生，但程序性坏死抑制剂Nec-1不影响该过程。

【复制叉不稳定性引发DNA复制灾难】
除TIM降解策略外，研究还发现DNA聚合酶α（Pol α）抑制剂联合ATRi同样能触发复制灾难，诱导γH2AX全核分布和凋亡。值得注意的是，H2AX敲除细胞对Polαi/ATRi诱导的凋亡具有抗性，且H2AX S139A突变体无法挽救该表型，证实γH2AX不仅是标志物，更是复制灾难执行的关键效应分子。

【ssDNA缺口是DNA-PKcs激活的基础】
研究发现DNA-PKcs在染色质组分中富集，联合处理诱导其广泛核分布。RPA70敲除增强DNA-PKcs激活，证实RPA耗竭和ssDNA积累是触发因素。PARP1敲除或催化抑制可阻断DNA-PKcs激活，而MRE11抑制则阻止PARP1依赖的PAR化。DNA纤维实验证实，联合处理显著增加ssDNA缺口，该过程依赖MRE11活性。不同于CPT诱导的双链断裂（DSBs），复制灾难主要表现为单链断裂（SSBs），且53BP1焦点不明显，支持ssDNA缺口（而非DSBs）是细胞毒性主要来源。

这项研究系统阐明了DNA复制灾难中细胞命运决定的分子机制，提出三层调控模型：首先，MRE11扩展的ssDNA缺口被PARP1识别，启动DNA-PKcs激活；其次，DNA-PKcs通过CHK1激活JNK，后者增强p53活性和γH2AX全核分布；最后，p53靶基因（如PIG3）形成正反馈放大死亡信号。该发现不仅解释了为何某些基因毒性疗法能克服TIS，还为联合用药策略提供了理论依据——通过靶向DNA-PKcs/JNK/p53轴的关键节点，可能增强现有ATRi/PARPi疗效。特别值得注意的是，研究证实ssDNA缺口（而非传统认为的DSBs）是复制灾难的主要毒性损伤，这一认识将推动针对复制间隙的新型抗癌策略开发。