优化lacZ qPCR检测技术：提升饮用水大肠菌群定量分析与风险监测能力

针对传统培养法检测饮用水大肠菌群(coliforms)存在的时效性差、灵敏度低等问题，格拉斯哥大学团队通过构建1292条lacZ基因数据库，开发出新型LZ1引物组，建立灵敏度达1000 copies/μL的qPCR检测体系。该技术可同步检测多种病原体，为饮用水微生物风险定量评估(QMRA)提供新工具。

　　

饮用水安全一直是公共卫生领域的核心议题。传统上，水务部门依赖培养法检测大肠菌群(coliforms)作为水质指标，这种方法需要24-48小时才能获得结果，且对"存活但不可培养"(VBNC)状态的细菌检出率不足23-70%。更关键的是，现行标准仅关注大肠杆菌(E. coli)等有限菌种，忽视了其他潜在病原体如军团菌(Legionella pneumophila)的存在。随着分子生物学发展，定量PCR(qPCR)技术因其快速、灵敏的特性，有望弥补传统方法的不足。

格拉斯哥大学与苏格兰水务公司的联合团队在《Journal of Applied Microbiology》发表研究，通过系统评估现有引物并开发新型lacZ基因检测体系。研究人员首先构建包含1292条lacZ序列的数据库，利用MAFFT比对和MRBAYES系统发育分析揭示大肠菌群的遗传多样性。通过PrimerProspector软件设计LZ1等新型引物组，在实验验证中实现对87.5%测试菌株的特异性检测，灵敏度达1×10³ CFU/100mL。

关键技术包括：1)基于NCBI数据库的lacZ序列生物信息学分析；2)使用环境分离菌株（来自饮用水源）构建测试菌株库；3)SYBR Green qPCR优化；4)与膜过滤(MLGA)和流式细胞术(FCM)的平行比对；5)采用Weibull Type II模型计算检测限。

研究结果显示，新型LZ1引物组(CCGWGYRTKATCATCTGGTC/TSATCSACGCGSGCGTACAT)在系统发育分析中覆盖81.85%数据库序列。实验验证表明其对大肠菌群的检出率显著优于传统引物LZ2（75%）和LZ3（100%），且qPCR效率达86.53%。值得注意的是，在1×10³-10⁸ CFU/100mL浓度范围内，qPCR结果与培养法高度相关(R²=0.88)。但研究也发现气单胞菌(Aeromonas veronii)等非大肠菌群会产生假阳性信号，反映出基于lacZ基因检测的固有局限。

在讨论环节，作者强调该技术不能完全替代现行标准方法，但可作为定量微生物风险评估(QMRA)的重要补充。通过同时检测多种病原体靶标，结合流式细胞术和宏基因组测序，能构建更全面的水质安全预警体系。研究建议采样时过滤2L水样并设置3个重复，可显著提高低丰度菌株检出率。该成果为理解饮用水系统中生物膜菌群动态及优化消毒工艺提供了新工具。

这项研究的创新性在于：首次建立覆盖1292条lacZ序列的分析数据库；开发的LZ1引物组实现单日内完成检测；证实分子检测与培养法的数据可比性。未来研究可结合PMAxx(propidium monoazide)处理区分活/死菌，进一步提升检测准确性。该技术框架也为其他环境微生物的快速检测提供了可借鉴的方法学范式。