人源己糖激酶3同源调节残基的鉴定揭示其与己糖激酶1共享的变构界面机制

本研究通过解析人源己糖激酶3（HK3）N端结构域的低亲和力葡萄糖结合位点（Kd=3.2±0.4 mM）与C端催化域的高亲和力位点（Kd=6.2±0.6 μM），揭示Asn221突变使底物抑制降低30倍，并证实Asp264-Arg807静电相互作用在HK1与HK3变构调控中的保守性，为理解脊椎动物HK家族变构机制进化提供新见解。

　　

葡萄糖代谢是生命活动的核心过程，而己糖激酶（Hexokinase, HK）作为糖酵解第一步的关键限速酶，其调控机制一直是代谢研究的热点。脊椎动物中存在四种HK同工酶（HK1-4），其中HK3因其独特的葡萄糖浓度依赖性底物抑制现象备受关注。然而，这种同源调节（homotropic regulation）的分子基础及其与HK1等家族成员的进化关系尚不明确。佛罗里达州立大学的研究团队通过多学科手段揭示了HK3变构调控的结构基础，相关成果发表于《Archives of Biochemistry and Biophysics》。

研究采用位点定向突变（site-directed mutagenesis）构建N221A等变异体，通过稳态动力学分析测定K_m、K_i等参数，分离表达N端（HK3N）和C端（HK3C）结构域进行功能验证，并利用生物信息学分析保守位点。样本来源于人源HK3基因工程菌表达系统。

【INTRODUCTION】
HK家族在进化过程中通过基因复制产生功能分化。HK1受葡萄糖-6-磷酸（G6P）异源抑制（heterotropic inhibition），而HK3则表现出葡萄糖浓度超过阈值时的同源抑制。这种差异提示不同HK成员可能采用相似的变构界面但不同的效应分子结合位点。

【Site-directed mutagenesis and the design of isolated N- and C-domain constructs】
通过QuikChange II和Q5突变试剂盒构建N221A突变体及分离结构域。序列分析发现Asp264和Arg807在HK1/HK3中高度保守，这两个残基在HK1中已知参与变构信号传递。

【Substrate inhibition is an inherent trait of the human HK3 C-terminal domain and is amplified by glucose binding at the N-terminal domain】
动力学数据显示：HK3C本身具有微弱底物抑制（K_i=11±2 mM），而完整HK3抑制强度提高30倍，证明N端结合增强效应。N221A突变使K_i值从11 mM升至330 mM，但K_m（53±1 μM）不变，说明该位点特异性调控抑制而非催化。

【DISCUSSION】
研究首次证实：1）HK3N的低亲和力位点（3.2 mM）与生理葡萄糖波动范围重叠，可能作为代谢传感器；2）D264-R807盐桥在HK1/HK3间功能保守，提示变构信号通过相似界面传递；3）结构域分离实验表明变构需要共价连接，否定了游离结构域反式作用的假说。

【CONCLUSIONS】
该工作阐明了HK3同源抑制的双位点模型：高亲和力C端负责催化，低亲和力N端介导调节。这种"分域协作"模式与HK1的异源调节共享静电相互作用网络，为设计HK亚型特异性调节剂奠定基础。研究还暗示脊椎动物HKs可能起源于具有可变效应分子结合域的祖先蛋白，通过局部适应获得不同的调控特性。