类器官单层培养系统与受精报告基因：揭示隐孢子虫有性生殖机制的新工具

（编辑推荐）本研究利用类器官来源单层细胞（ODM）建立支持隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）完整生命周期的体外培养体系，并开发受精报告基因（DiCre系统），首次实现受精过程的时空可控监测。该系统克服传统HCT8细胞仅支持无性繁殖的局限，通过性阶段特异性启动子（HAP2/COWP1）调控荧光蛋白转换（mCherry→mNeonGreen），为研究宿主-病原体互作及抗性药物开发提供新平台。

　　

类器官单层培养系统突破隐孢子虫研究瓶颈
隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）是导致全球儿童腹泻的主要病原体，其有性生殖阶段的研究长期受限于培养技术。本研究创新性地将小鼠肠道干细胞分化为类器官来源单层细胞（ODM），通过阶梯式培养基调整（50%→5% SCMM转DM）在5天内构建出包含杯状细胞、潘氏细胞等全部分化肠上皮类型的模型。透射电镜证实ODM具有紧密连接和微绒毛结构，qRT-PCR显示分化标志物Muc2表达显著上调而干细胞标记Lgr5下降。

受精报告基因实现精准时空监测
团队开发的受精开关报告系统采用双组分DiCre技术：将Cre片段分别置于微配子体特异性启动子HAP2（cgd8_2220）和巨配子体特异性启动子COWP1（cgd6_2090）下游。仅在受精后雷帕霉素诱导下，FRB/FKB12二聚化触发Cre重组酶切除loxP-mCherry-STOP序列，使子代寄生虫表达mNeonGreen。小鼠体内验证显示雷帕霉素处理后>95%卵囊发生荧光转换，PCR证实mCherry序列精确切除。

ODM系统支持完整生命周期
感染实验显示ODM可维持隐孢子虫感染21天以上，10⁶接种剂量产生的寄生泡（PV）数量显著高于低剂量组（4.1×10⁵ vs 2.3×10⁴）。值得注意的是，卵囊产量与接种剂量无关，流式细胞术检测到含双荧光（mNG⁺/tdT⁺）的罕见卵囊。透射电镜观察到ODM中自感染现象——存在含多核的mNeonGreen⁺裂殖体，证实第二代寄生虫发育。

传统培养体系的意外发现
在HCT8细胞中，受精开关报告系统检测到约0.5%的mNeonGreen⁺克隆，纤维连接蛋白包被使阳性率提升至1.2%。这些位于感染后期（90 hpi）的荧光簇提示HCT8可能微弱支持受精，但产生的卵囊不足以感染小鼠。相比之下，ODM衍生的卵囊能使全部受体IFNγ^-/-小鼠感染，粪便纳米荧光素酶（nLuc）活性持续阳性。

技术优势与应用前景
该ODM系统采用无血清限定培养基提升重复性，较既往气液界面（ALI）培养缩短6天制备周期。性阶段特异性报告基因可筛选干扰受精的小分子药物，其空间控制特性避免传统杂交实验对重组事件的低估。未来结合CRISPR/Cas9基因编辑与免疫细胞共培养，可深入探究隐孢子虫-宿主特异性及上皮细胞更新机制，为开发缩短病程的性生殖抑制剂提供新思路。