瘤胃细菌牛链球菌S1中CcpA介导的细胞能量代谢调控机制及其在瘤胃酸中毒防治中的潜在应用

本研究通过敲除牛链球菌S1的碳分解代谢物阻遏蛋白（CcpA），结合5/50 mM葡萄糖浓度处理，利用LC-MS/MS揭示了51种能量代谢物的动态变化。发现CcpA通过调控EMP途径通量、FBP浓度及PPP活性，影响丙酮酸发酵方向（乳酸/甲酸转化），并鉴定谷氨酰胺和UDP-GlcNAc为关键生物标志物，为靶向调控瘤胃微生物代谢以缓解高精料饲喂导致的亚急性瘤胃酸中毒（SARA）提供新策略。

　　

ABSTRACT

研究通过对比5 mM与50 mM葡萄糖条件下野生型与ccpA敲除牛链球菌S1的代谢谱，鉴定出51种代谢物分属7大类。PCA与OPLS-DA分析显示各组代谢特征显著差异：高糖野生型（HGWT）富集EMP途径中间产物（如FBP、DHAP）及乳酸，而ccpA敲除（HGKO）组UDP-GlcNAc和甲酸升高。KEGG预测显示代谢变化主要涉及碳代谢、氨基酸代谢及核苷酸代谢。随机森林算法确定谷氨酰胺和UDP-GlcNAc为关键生物标志物。

IMPORTANCE

牛链球菌S1是瘤胃乳酸过量导致酸中毒的核心菌株。ccpA敲除通过降低EMP通量和改变FBP对LDH/PFL的调控，使发酵方向从乳酸转向甲酸，同时破坏PPP途径影响核苷酸合成。该发现为通过微生物代谢干预改善反刍动物健康提供理论依据。

INTRODUCTION

高精料饲喂导致瘤胃乳酸积累，牛链球菌的过度增殖是主因。CcpA作为碳代谢全局调控因子，通过结合靶基因启动子区的CRE序列调控LDH和PFL表达。前期研究表明ccpA敲除可降低乳酸产量并改变有机酸比例，但代谢物层面的机制尚未阐明。

RESULTS

有机酸谱分析

ccpA敲除使乳酸浓度降低60%（P<0.05），甲酸增加2.1倍，且高糖条件下乙酸显著升高。低糖环境整体抑制有机酸生成。

能量代谢物特征

HGWT组ATP、FBP、丙酮酸等EMP产物丰度最高；HGKO组6-磷酸葡萄糖酸和UDP-GlcNAc上升；低糖野生型（LGWT）则富集谷氨酰胺和dTMP。

代谢通路调控

ccpA敲除使EMP中间产物（FBP、3-磷酸甘油酸）减少50%以上，同时PPP代谢物D-核酮糖-5-磷酸下降。低糖条件下谷氨酰胺通过糖异生缓解碳源不足，而ccpA敲除抑制该过程。

核苷酸代谢异常

低糖限制鸟嘌呤合成但促进dTMP积累；ccpA敲除则通过抑制PPP同时干扰嘌呤/嘧啶合成，导致IMP和UMP比例失衡。

DISCUSSION

研究揭示CcpA通过三重机制调控代谢：

1. 碳流分配：高糖促进EMP通量，ccpA敲除使碳流向甲酸生成；
2. 氨基酸补偿：低糖时谷氨酰胺通过GS酶（gltAB编码）维持碳氮平衡；
3. 核苷酸调控：ccpA通过PPP影响核苷酸前体供应，导致生长受限。

结论

如图6所示，CcpA与葡萄糖协同调控牛链球菌S1的代谢网络：低糖限制EMP通量并激活氨基酸利用，ccpA敲除则通过FBP-LDH/PFL轴和PPP重塑代谢流向。该研究为开发基于CcpA靶点的瘤胃微生物调控技术奠定基础。

MATERIALS AND METHODS

实验采用厌氧培养系统（DG250），在pH 6.5、37℃条件下培养野生型与ccpA敲除菌株。代谢物通过UPLC-MS/MS（QTRAP 6500+）检测，采用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱分离，正负离子模式扫描。数据分析使用R语言（v4.3.3）完成PCA、OPLS-DA及随机森林建模。