金黄色葡萄球菌V8蛋白酶通过新型N端组学技术揭示的中性粒细胞路径降解组调控机制

本研究开发了新型N端组学方法TAGS-CR，系统解析了金黄色葡萄球菌V8蛋白酶（SspA）在人类中性粒细胞中的346个底物靶点，揭示了该毒力因子通过切割整合素αL（ITGAL）、Rac2、髓过氧化物酶（MPO）等关键蛋白，破坏中性粒细胞迁移、脱颗粒、活性氧（ROS）产生及凋亡通路的免疫逃逸机制。实验证实ΔsspA突变株在中性粒细胞内生存能力显著降低，为宿主-病原体互作研究提供了新视角。

　　

Development of the terminal amine guanidination of substrates-charge reversal (TAGS-CR) N-terminomic methodology
研究团队创新开发了TAGS-CR技术，通过胍基化标记N端α-氨基和赖氨酸ε-氨基，结合强阳离子交换（SCX）富集策略，克服了传统TAILS方法中聚合物单次使用的局限性。该方法利用1H-吡唑-1-甲脒进行标记，经还原烷基化、胰酶消化后，通过硫酸化负电荷修饰实现内源性肽段去除，显著提高了蛋白酶底物鉴定的通量和准确性。

Uncovering V8 substrates within neutrophil proteomes
应用TAGS-CR技术对HL-60分化中性粒细胞蛋白组进行分析，鉴定出346个V8特异性底物及454个切割位点。序列分析显示90%切割发生在谷氨酸（E）的羧基端，符合V8的底物偏好性。ICELOGO分析进一步揭示P1′位丙氨酸/甘氨酸、P2位亮氨酸、P4′位缬氨酸的显著富集，而脯氨酸在P3/P1′位的抑制效应与MEROPS数据库记载的蛋白酶共性规律一致。

Ingenuity pathway analysis (IPA) highlights host canonical signaling pathways targeted by V8
IPA通路分析发现V8靶向920条宿主信号通路，核心涉及：

1. 白细胞外渗信号（Leukocyte extravasation signaling）
2. 整合素细胞表面互作（Integrin cell surface interactions）
3. NADPH氧化酶复合体调控的ROS产生途径
4. 吞噬体成熟（Phagosomal maturation）
5. 凋亡内源性通路（Intrinsic apoptosis pathway）

TAGS-CR highlights V8 targets essential for leukocyte extravasation
V8通过切割粘附关键蛋白调控中性粒细胞迁移：

• 膜突蛋白（Moesin）在α螺旋结构域396位点的切割破坏其连接肌动蛋白与质膜的功能
• 整合素αL（ITGAL/CD11a）在FG-GAP重复序列477/510位点的切割干扰钙离子结合基序，导致LFA-1复合体功能障碍
• Rho家族GTP酶（Rac2/RhoA）的切割影响细胞骨架重组
  免疫印迹验证显示ITGAL在V8处理后产生72 kDa C端片段，模拟了白细胞粘附缺陷症（LAD-1）的病理特征。

V8 further hampers neutrophil migration by targeting integrin activators
V8切割fermitin家族同源蛋白3（Kindlin-3）的FERM结构域（336/500位点），该蛋白与ITGB2结合介导LFA-1"由内向外"信号激活。免疫印迹显示V8处理组出现18 kDa N端片段，与钙蛋白酶（calpain）内源性切割产生的42 kDa片段共存，揭示细菌蛋白酶与宿主蛋白酶对整合素激活器的协同调控。

Dysregulation of neutrophil degranulation by V8
V8通过多重机制削弱杀菌颗粒功能：

• 组织蛋白酶C（Cathepsin C）切割影响丝氨酸蛋白酶激活级联
• 髓过氧化物酶（MPO）412位点切割破坏血红素结合簇（495-505位点），免疫印迹检测到38 kDa C端片段
• 内体适配蛋白p14（LAMTOR2）切割导致溶酶体颗粒结构异常
  这些发现与金黄色葡萄球菌已知的过氧化物酶抑制剂（SPIN）形成互补防御策略。

Oxygen-dependent host-defense mechanisms are vulnerable to V8 activity
V8对ROS产生系统的全面破坏：

• 丙酮酸激酶PKM2（355/283/481位点切割）影响糖酵解限速步骤，免疫印迹显示25-35 kDa降解片段
• 蛋白激酶Cα（PKC-alpha）283位点切割破坏其C2钙离子结合域
• p47^phox（NCF-1C）33位点切割干扰PX结构域膜定位
• 钙网蛋白（Calreticulin）128/342位点切割影响内质网伴侣功能

N-terminomics predicts V8 modulation of phagocytosis
肌球蛋白-9（Myosin-9）、β-肌动蛋白等细胞骨架蛋白的切割经SDS-PAGE验证（β-actin产生12/15 kDa片段），导致伪足延伸障碍。该机制与已知的葡萄球菌蛋白A（Spa）抗调理作用形成协同免疫逃逸网络。

V8 degrades apoptotic signaling proteins
促凋亡蛋白切割揭示V8的"特洛伊木马"策略：

• BID在53位点切割模拟caspase-8激活效应
• BAK1 α1-α2环（60位点）切割解除M60稳定作用
• BAX 45位点切割诱发构象变化
  重组BAK1酶切实验经质谱验证产生60位点特异性肽段，提示V8可能通过诱导凋亡促进细菌播散。

The V8 protease facilitates survival of S. aureus within human leukocytes
中性粒细胞感染模型显示：ΔsspA突变株24小时存活率较野生型（LAC）显著降低（P<0.005），而sspA回补株（ΔsspA+sspA）恢复野生表型，证实V8通过上述多靶点调控促进胞内寄生。

Summary and conclusion
TAGS-CR技术革新了蛋白酶底物鉴定方法，揭示V8通过"多管齐下"策略瓦解中性粒细胞防御：从初始迁移抑制、到胞内杀菌系统破坏、最终诱导凋亡。这些发现为理解复发性金黄色葡萄球菌感染提供了分子基础，并为针对毒力因子的精准干预提供新靶点。