无DNA提取的腔室数字PCR技术在基因兴奋剂检测中的应用研究

本研究针对马术运动中基因兴奋剂（gene doping）检测的难题，开发了一种无需DNA提取的直接腔室数字PCR（cdPCR）方法。研究人员以马促红细胞生成素（EPO）转基因模型为靶点，通过优化裂解缓冲液（Lysis Buffer S Ver.2）预处理血浆样本，实现了低至1,000 copies/μL的灵敏检测，显著缩短了检测时间并降低背景干扰。该方法为马术反兴奋剂提供了高效、可靠的技术支持，并拓展了法医生物技术中快速核酸检测的应用前景。

　　

基因兴奋剂检测的困境与突破
马术运动的公平性正面临基因兴奋剂（gene doping）的严峻挑战。通过注射外源基因（如促红细胞生成素EPO）来增强赛马体能的行为，不仅违背竞技伦理，还可能引发动物健康风险。尽管国际赛马组织已明令禁止，但现有检测技术依赖耗时的血浆DNA提取步骤，效率低下且易污染。日本竞马协会化学实验室（Racing Chemistry Laboratory）的研究团队在《Forensic Science International》发表论文，提出了一种革命性的解决方案——无需DNA提取的直接腔室数字PCR（cdPCR）检测技术。

关键技术方法
研究团队采用腔室数字PCR（cdPCR）技术，通过微流控将样本分配至20,000个独立反应腔室，结合靶向EPO外显子连接区的水解探针，直接分析经Lysis Buffer S Ver.2处理的马血浆。实验样本包括30匹纯血马（Thoroughbred）的基线血浆和质粒注射后的模拟阳性样本，检测限低至1,000 copies/μL。

研究结果

Collection of blood and separation of plasma
通过离心分离K₂EDTA抗凝马血浆，验证了-20°C储存样本的稳定性，为后续实验提供标准化样本来源。

Comparison of detection systems and the effects of LBS2
对比显示，Lysis Buffer S Ver.2（LBS2）处理的血浆与纯化DNA的检测效率无显著差异（P>0.05），且背景信号均低于阈值1.0，证实其可替代传统DNA提取步骤。

Discussion
cdPCR技术通过ROX染料校正腔室背景噪声，避免了ddPCR（微滴数字PCR）所需的乳化步骤，将检测流程缩短至3小时，灵敏度与常规qPCR相当。在模拟质粒注射马模型中，成功检出EPO转基因，证实其实际应用价值。

Conclusions
该研究建立的cdPCR方法突破了传统基因兴奋剂检测的技术瓶颈，其“样本裂解即上机”的流程设计显著提升检测通量。1,000 copies/μL的灵敏度可覆盖临床相关浓度，而仅需0.55 μL血浆的微量需求尤为适合珍贵样本分析。这一技术不仅为马术反兴奋剂提供了标准化工具，其“无提取”策略更可推广至法医微量DNA检测、传染病快速诊断等领域。

研究意义
日本团队的工作首次将cdPCR技术引入反兴奋剂领域，其创新性体现在：1）消除DNA提取步骤，降低交叉污染风险；2）利用EPO外显子连接区探针确保转基因特异性；3）通过ROX背景校正提升结果可靠性。该技术有望成为国际马联（IFHA）基因兴奋剂筛查的标准方法，并为其他物种的转基因滥用监测提供技术范式。