在线DPPH辅助多模态去重复工作流在复杂混合物中鉴定抗氧化化合物的创新应用——以超临界CO2提取马卡延胡椒副产物为例

本研究针对天然复杂提取物中生物活性成分鉴定难题，开发了集成在线DPPH筛选、高分辨质谱(HRMS/MS)和13C NMR的快速去重复策略。通过离心分配色谱(CPC)与高效液相色谱(HPLC)离线联用技术，成功从马卡延胡椒副产物中鉴定出50种抗氧化成分，包括黄酮类、咖啡酸酯等，为化妆品行业可持续生物活性成分开发提供了高效解决方案。

　　

在化妆品行业追求天然成分与可持续发展的大背景下，如何高效鉴定复杂天然提取物中的活性成分成为关键科学难题。传统生物导向分馏方法存在耗时长、成本高、溶剂消耗大等缺陷，而现有DPPH筛选技术又难以实现微量成分的精准鉴定。法国研究团队在《Journal of Chromatography A》发表的研究，创新性地将多模态分析技术整合应用于马卡延胡椒（Zanthoxylum myriacanthum）副产物的深度开发。

研究采用CPC×HPLC离线全二维分离体系，结合在线DPPH-HRMS/MS-DAD三联检测系统，构建了"CPC(NMR)*HPLC-(DAD-HRMS/MS)-DPPH-DAD"集成工作流。通过CATHEDRAL注释工具对HRMS/MS和¹³C NMR数据进行多维度比对，显著提升了化合物注释的可信度等级。

CPCxHPLC离线全面耦合
研究首先对超临界CO₂提取后的马卡延胡椒残渣进行微波辅助乙醇提取，获得得率达18.48%的粗提物。通过优化CPC溶剂系统（乙酸乙酯/乙醇/水，4:1:5，v/v/v），实现了提取物的高效预分离，为后续HPLC-DPPH分析奠定基础。

在线DPPH活性筛选
建立HPLC-DAD-HRMS/MS在线联用系统，在280nm波长下监测色谱峰。创新性地在柱后引入DPPH反应环，通过517nm处吸光度变化实时检测自由基清除活性，实现活性成分的"在线"定位。

结构鉴定与注释
采用CaraMel工作流处理¹³C NMR数据，结合HRMS/MS碎片信息，构建了包含50种活性成分的数据库。其中黄酮类化合物通过特征母核离子（m/z 285.0401 [M-H]^-）及典型的RDA裂解途径被确认，咖啡酸酯类则通过162amu的咖啡酰基特征碎片得以鉴定。

结论与意义
该研究建立的集成化工作流突破了传统天然产物活性成分鉴定的技术瓶颈，首次系统揭示了马卡延胡椒副产物中的抗氧化成分谱系。通过CPC预富集使微量活性成分检测灵敏度提升3个数量级，而多模态数据融合策略将化合物注释置信度提高至Level 1（明确结构）。研究成果不仅为化妆品行业提供了可持续原料开发范式，其技术路线更可推广至其他复杂天然混合物的快速表征，推动分析化学与天然产物研究的交叉创新。