基于探针定量PCR技术的家蚕微粒子虫(Nosema bombycis)检测方法开发及其在蚕种检疫中的应用

【编辑推荐】为解决传统显微镜检测法(FMM)在蚕业检疫中效率低、主观性强的问题，研究人员开发了靶向N. bombycis SSU rRNA基因的探针qPCR技术，灵敏度达15 fg基因组DNA，可提前13-14天检出病原体，在3616份母蛾样本中阳性符合率达93.82%，显著提升蚕种检疫效率。该成果为蚕业微孢子虫分子检测提供了标准化方案。

　　

在丝绸产业的命脉——家蚕养殖领域，一种名为"微粒子病"的瘟疫已肆虐了160余年。这种由Nosema bombycis（家蚕微粒子虫）引发的疾病，能通过母体垂直传播给下一代蚕卵，导致整批蚕种报废。自1857年Carl N?geli首次分离出病原体以来，蚕农们一直依赖路易·巴斯德发明的母蛾显微镜检测法(FMM)，这种方法需要将雌蛾研磨后人工镜检孢子，不仅耗时费力，更可能因操作者主观判断失误漏检低浓度感染样本。更棘手的是，现行检疫标准还要求对孵化后的F₁代幼虫进行确认性镜检，整个过程需额外耗费13-14天等待孵化和自然死亡，严重制约蚕种生产效率。

针对这一产业痛点，中国广西蚕业技术研究院联合多家单位的研究团队在《Journal of Invertebrate Pathology》发表突破性成果。他们创新性地开发出基于小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)基因的探针定量PCR(qPCR)检测体系，将检测灵敏度提升至15飞克(fg)级基因组DNA水平，相当于传统镜检极限的千分之一。这项技术不仅能特异性识别N. bombycis及其近缘种Vairimorpha necatrix BM，还可实现感染后2天中肠组织、3天血淋巴、6天粪便的早期追踪，为蚕病防控赢得宝贵时间窗。

研究团队采用多阶段验证策略：首先通过特异性实验证实引物可扩增N. bombycis的225 bp片段和V. necatrix BM的241 bp产物；随后建立标准曲线验证定量可靠性；最终对7281份生产样本（含3616份原种母蛾、2643份普通母蛾及1022份F₁幼虫）进行平行检测。结果显示，qPCR与镜检的阳性符合率最高达96.48%，更关键的是，它能检出镜检漏诊的43.51%可疑样本。在F₁代蚕卵直接检测中，该方法成功避免21.21%健康蚕卵被误杀，大幅降低产业损失。

【关键技术】研究采用探针qPCR技术，靶向SSU rRNA保守序列设计特异性引物；通过梯度稀释建立标准曲线评估灵敏度；使用广西蚕业科学研究所提供的Guican No.5蚕种构建感染模型；样本涵盖母蛾研磨液、幼虫匀浆及蚕卵提取物三类基质；采用KOH预处理消除PCR抑制物干扰。

【主要发现】

1. 特异性验证：引物能区分微孢子虫与其他蚕病原体（如BmNPV、BmCPV），且不与家蚕基因组交叉反应。
2. 灵敏度测试：对N. bombycis基因组DNA的检测限达15 fg/μL，比常规PCR高100倍。
3. 动态监测：qPCR可在感染后2 dpi（天）检出中肠定植，早于镜检发现成熟孢子的时间点。
4. 大样本验证：在F₁幼虫检测中，qPCR使检疫周期从14天缩短至1天，且阳性预测值提升58.95%。

【结论意义】该研究首次系统评估了qPCR在蚕种全生产链检疫中的应用价值。相比传统方法，其优势体现在：① 突破镜检对孢子成熟度的依赖；② 实现F₁代蚕卵的直接无损检测；③ 通过标准化Ct值判定，消除人为误差。研究团队特别指出，该方法已整合入中国农业行业标准(NY/T 3677-2020)，为建立"母蛾筛查-qPCR复核-蚕卵抽检"的三级防控体系提供技术支撑，对保障丝绸产业生物安全具有里程碑意义。正如通讯作者张智强调的，这项分子检测技术的推广，将推动蚕业检疫从经验判断迈向数字化精准时代。