单次切向流过滤技术(SPTFF)在腺相关病毒澄清细胞裂解液浓缩与纯化中的应用研究

本研究针对腺相关病毒(AAV)下游制造过程中传统批次超滤导致的剪切敏感性和效率瓶颈，创新性地采用单次切向流过滤(SPTFF)技术，通过筛选300 kDa再生纤维素(RC)膜并确定临界污染通量(Jfoul)，实现了AAV高回收率(>90% HCP去除)且低剪切损伤的连续化处理，为基因治疗药物生产提供了新策略。

　　

基因治疗领域近年来迎来爆发式增长，其中腺相关病毒(AAV)因其卓越的神经组织靶向性和安全性成为明星载体。然而在商业化进程中，AAV的低生产效价和脆弱性成为制约因素——传统批次超滤过程中反复泵送产生的剪切力会导致病毒衣壳(capsid)聚集或碎裂，而冗长的多步纯化又显著增加成本。更棘手的是，宿主细胞残留蛋白(HCP)的去除效率直接影响最终产品的安全性。这些痛点促使研究者探索既能保护AAV完整性又能实现高效纯化的新型下游工艺。

来自MAST中心的研究团队在《Journal of Membrane Science》发表的研究中，首次将单次切向流过滤(SPTFF)技术引入AAV澄清细胞裂解液(CCL)处理领域。这种连续化技术通过单次泵送和精确控制渗透通量，既避免了传统切向流过滤(TFF)的多次循环损伤，又能同步实现浓缩与纯化。研究团队首先通过剪切敏感性实验证实：当AAV溶液经历超过5次泵循环后，定量PCR(qPCR)检测显示病毒基因组(vg)滴度下降15%，动态光散射(DLS)则检测到粒径增大现象，这为SPTFF的工艺优势提供了理论依据。

关键技术包括：采用不同截留分子量(100-500 kDa)的膜筛选AAV保留率与HCP去除效果；通过通量阶梯实验确定临界污染通量(J_foul)；引入带正电荷吸附过滤器预处理降低料液污染负荷；使用酶联免疫吸附试验(ELISA)定量HCP残留，qPCR分析病毒回收率。实验材料采用Spark Therapeutics提供的AAV2血清型，经HEK293细胞三质粒转染系统生产。

AAV Clarified Cell Lysate Material Generation
通过三质粒转染HEK293细胞生产AAV2，裂解后经Clarisolve? 20MS深层过滤获得CCL，初始滴度为2×10¹² vg/mL。

AAV Aggregation and Shear Sensitivity
剪切力实验证明传统批次处理中，每增加一次泵循环会导致0.8%的AAV聚集，而SPTFF单次通过模式使聚集率降至0.1%以下。

Conclusions
研究确定300 kDa再生纤维素(RC)膜在J_foul=45 LMH条件下可实现AAV完全截留(回收率>99%)和>90% HCP去除。带正电预处理使J_foul提升27%，显著延长膜通量稳定时间。

这项研究的意义在于：首次建立AAV生产的SPTFF工艺标准，相比传统TFF减少80%剪切暴露时间；通过"膜筛分+电荷吸附"协同机制实现纯化浓缩一步完成；为连续化生物制造提供关键技术模块。值得注意的是，该方法特别适用于治疗神经系统疾病的AAV血清型(如穿越血脑屏障的AAV9)，其脆性衣壳对剪切力更为敏感。未来可进一步探索SPTFF与亲和层析的联用，构建端到端连续生产平台。