血液RNA测序全流程质量控制框架的构建及其在生物标志物发现中的临床应用价值

本研究针对RNA测序(RNA-seq)临床转化中因流程变异导致的可靠性问题，开发了覆盖前处理(pre-analytical)、测序(analytical)和后分析(post-analytical)的全流程质控框架。通过引入二次DNase处理降低gDNA污染，显著减少基因间区比对率，为血液转录组生物标志物发现提供了标准化解决方案，对推动RNA-seq临床标准化具有重要价值。

　　

在分子诊断领域，新一代RNA测序(RNA-seq)技术犹如一把"分子显微镜"，能全景式扫描疾病相关的转录组变化。然而这把利器在临床应用中却遭遇尴尬——尽管在科研领域大放异彩，真正进入临床诊断的案例却寥寥无几。究其原因，RNA分子本身的"娇气"特性成为最大障碍：从采血到数据分析，温度波动、操作差异、甚至试管的选择都可能让检测结果"失之毫厘，谬以千里"。更棘手的是，目前缺乏覆盖全流程的质量控制(QC)标准，使得不同实验室的数据如同"方言"般难以互通。

针对这一瓶颈问题，来自国际研究团队在《The Journal of Molecular Diagnostics》发表重要成果。研究人员构建了首个面向血液转录组生物标志物发现的端到端QC框架，通过系统分析发现：前处理阶段的质量问题竟占全部失败的70%以上，特别是基因组DNA(gDNA)污染成为"隐形杀手"。令人振奋的是，简单的二次DNase处理就像"分子橡皮擦"，能显著清除gDNA污染，使基因间区比对率下降超过50%。这项研究为RNA-seq临床转化提供了可复制的质控蓝图，其意义不亚为分子诊断领域树立了新的"度量衡"标准。

关键技术方法包括：使用PAXgene Blood RNA管采集全血样本；建立覆盖pre-analytical（标本重量、RNA完整性数RIN值）、analytical（测序深度、比对率）和post-analytical（批次效应校正）的三级质控体系；引入spike-in RNA对照监测技术变异；针对高gDNA污染样本开发二次DNase处理方案。研究对象涵盖代谢疾病、神经退行性疾病患者及健康对照的临床队列。

【Multi-layered QC Framework Increases Efficiency and Application Flexibility】
通过建立分级质控体系，研究发现PAXgene管采集的血液标本经-70°C保存后仍保持良好RNA完整性。但约23%样本出现gDNA污染超标，导致NGS数据中5%-15% reads错误比对到基因间区。创新性引入的二次DNase处理使这类污染降低至可接受水平（p<0.01），且不影响下游转录组分析。

【Discussion】
与DNA测序(DNA-seq)已建立CLIA认证标准不同，RNA-seq临床转化缺乏统一规范。本研究首次证明前处理质控的关键作用，特别是揭示gDNA污染对基因表达定量存在系统性干扰。提出的质控指标如RIN>7、DV₂₀₀>30%等参数，为行业提供了具体可执行的标准。

【Conclusions】
该研究确立了RNA-seq生物标志物发现的黄金标准：1)前处理阶段重点监控标本采集条件和RNA完整性；2)测序阶段需评估文库复杂度（如PCR重复率<20%）；3)生物信息学分析应采用ERCC spike-in标准化。这些发现为FDA未来制定RNA-seq临床指南提供了实证依据，将加速精准医疗发展。

特别值得注意的是，研究强调PAXgene管与Tempus管等不同采血管系统间的数据不可直接比较，这一发现对多中心研究设计具有重要指导意义。正如作者所言："没有质量控制的转录组数据就像没有校准的体温计——数字再漂亮也难担诊断重任"。这项研究为打破RNA-seq临床转化的"最后一公里"壁垒提供了关键技术支撑。