嗜热菌噬菌体Tt72裂解内肽酶LysTt72的晶体结构与热适应机制：一种新型M23家族金属肽酶的独特结构特征

本研究解析了嗜热菌噬菌体vB_Tt72编码的M23家族金属肽酶LysTt72的晶体结构（2.2 ?），揭示其通过独特的α-螺旋束和疏水核心实现98.3°C超高热稳定性，对革兰阴性菌（如Thermus spp.）和阳性菌（如S. aureus）均具裂解活性，为开发耐高温抗菌剂提供了新策略。

　　

在抗生素耐药性危机日益严峻的背景下，噬菌体裂解酶因其精准靶向细菌细胞壁的特性成为抗菌药物研发的新希望。尤其引人注目的是嗜热噬菌体编码的裂解酶，它们天生具备耐高温特性，但这类酶的稳定机制长期未明。更棘手的是，传统生物信息学指标（如EK/QH比值、CvP偏倚）在预测嗜热蛋白时频频失效——这正是Thermus thermophilus噬菌体vB_Tt72内肽酶LysTt72展现的谜题：其序列特征更接近中温蛋白，却能在99°C保持50%活性，熔解温度（T_m）高达98.3°C。

为破解这一矛盾，来自格但斯克大学等机构的研究团队通过X射线晶体学（2.2 ?分辨率）结合生物化学分析，首次揭示了这种M23家族金属肽酶的三维结构。研究发现，LysTt72仅40%结构与经典M23催化域（Pfam PF01551）同源，剩余60%由两个超长插入片段构成独特的α-螺旋束（α1-α5），其中α5螺旋的9个疏水残基形成独立疏水核心。这种"交织式延伸"结构颠覆了传统认知——通常认为热稳定蛋白会缩短表面环，而LysTt72却通过延伸环构建稳定模块。研究还发现4对二硫键（如Cys11-Cys327）和动态表面环的"减震器"作用共同维持结构稳定。

关键技术包括：纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）测定热稳定性、X射线晶体学解析结构（EMBL P13线站）、AlphaFold2模型辅助分子置换法解析相位问题，以及针对Thermus spp.和ESKAPE病原体的浊度降低实验（TRA）评估酶活。

结果解析
2.1 基因组分析与系统发育
通过BLASTP在154 kb的Tt72噬菌体基因组中鉴定出346-aa的lysTt72基因（GenBank PQ465150），与Thermus噬菌体φYS40/φTMA的同源性达87-88%，但与其他M23成员（如金黄色葡萄球菌LytM）同源性<37%。系统发育树显示Thermus来源的M23肽酶形成独立分支，暗示宿主-噬菌体协同进化。

2.2 酶学特性
最适活性条件为50°C/pH 9.5/25 mM KCl，对天然宿主T. thermophilus MAT72的裂解活性达100%，但对近缘种T. parvatiensis活性更高（109.1%）。意外的是，对沙门氏菌（28.2%）和金黄色葡萄球菌（6.7%）也显示交叉活性，透射电镜（TEM）证实其需氯仿处理穿透外膜发挥作用。

2.3 热稳定机制
序列参数（EK/QH=1.90，CvP=-10.4）错误归类为mesophilic蛋白，但nanoDSF显示其T_m=98.3±0.5°C，82°C以下构象稳定。晶体结构揭示α5螺旋的Tyr238/Tyr244芳香堆叠及Ile/Leu密集分布构成"分子螺栓"，与α1-α4螺旋交织成稳定模块。

2.5 结构创新性
DALI服务器分析显示，除M23催化域（含Zn²⁺配位三联体His115-Asp119-His208）外，其余结构未见报道。活性位点捕获的磷酸根以双齿形式配位Zn²⁺，而底物结合槽中意外发现大肠杆菌肽聚糖片段γ-d-Glu-m-A2pm-l-Lys，提示广谱识别潜力。

讨论与意义
该研究突破了"热稳定蛋白必缩短环"的传统认知，提出"延伸环构建稳定模块"的新机制。LysTt72的 interlaced α-helical bundle 结构为蛋白质工程提供了新范式——通过设计人工交织结构可增强酶的热稳定性。其独特的底物结合槽（容纳E. coli和T. thermophilus不同肽聚糖）暗示可改造为广谱抗菌剂，特别是针对耐多药革兰阴性菌（如A. baumannii）。研究还揭示了AlphaFold2在预测复杂折叠中的惊人准确性（与实验结构RMSD仅0.7 ?），为AI辅助结构生物学树立范例。

这项发表于《Journal of Structural Biology》的工作，不仅为极端环境酶进化研究提供新视角，更开辟了设计耐高温抗菌剂的新路径。未来通过VersaTile技术将LysTt72与穿透肽融合，有望开发出对抗ESKAPE病原体的"超级裂解酶"。