活性干燥本土共培养菌作为泰国咸鱼(Pla-ra)发酵加速剂与安全增强剂的实验室及规模化研究

为解决泰国咸鱼(Pla-ra)传统发酵周期长、安全性低的问题，研究人员通过基因组学和代谢组学技术筛选出具有蛋白酶活性、耐盐性和抗菌特性的本土菌株Bacillus subtilis UD6-2和Virgibacillus halodenitrificans NCFF-2，开发出活性干燥发酵剂。该发酵剂在10 kg和100 kg规模应用中，8周内实现与传统1年发酵相当的品质，显著提升挥发性/非挥发性代谢物水平，并抑制Staphylococcus aureus生长，为工业化生产标准化与安全提升提供新策略。

　　

泰国传统发酵鱼制品Pla-ra是东南亚饮食文化的重要载体，年产量超过4万吨，但其传统发酵需6-24个月，且高盐环境仍无法完全抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等病原体生长。漫长的生产周期和潜在安全风险制约了产业发展，亟需通过微生物技术实现工艺优化。

针对这一需求，来自朱拉隆功大学食品技术系的研究团队通过整合基因组学与代谢组学方法，从泰国本土Pla-ra样本中分离出两株具有应用潜力的菌株：Bacillus subtilis UD6-2和Virgibacillus halodenitrificans NCFF-2。研究证实这两株菌不仅具备关键蛋白酶活性和耐盐性（可耐受150 g L^-1 NaCl），还能抑制S. aureus生长。通过静态培养和米糠载体优化，团队开发出存活率>95%、可稳定保存6个月的活性干燥发酵剂。在10 kg和100 kg规模试验中，该发酵剂使发酵周期缩短至8周，其产物经SPME-GC/MS和¹H-NMR分析显示，关键风味物质如二甲基二硫醚（dimethyl disulfide）和甜菜碱（betaine）含量显著高于传统发酵产品，同时完全消除了S. aureus污染风险。相关成果发表于《LWT-Food Science and Technology》。

研究采用全基因组测序(WGS)鉴定菌株特性，通过静态培养优化生物量生产，利用米糠基质开发活性干燥制剂，并在不同规模(2 kg/10 kg/100 kg)进行发酵验证。代谢组学分析采用SPME-GC/MS检测挥发性物质，¹H-NMR分析非极性代谢物，结合RevT-PCR-DGGE监测微生物群落动态。

3.1 菌株特性分析
通过VITEK? 2生物分型、16S rRNA测序和WGS确认UD6-2为Bacillus subtilis（同源性99.37%），NCFF-2为Virgibacillus halodenitrificans（同源性99.40%）。基因组分析显示UD6-2含8个细菌素基因簇，NCFF-2携带谷氨酰胺酶基因（与鲜味相关）。体外实验证实UD6-2对S. aureus抑制效果显著（表S10）。

3.2 活性干燥发酵剂开发
静态培养（0 rpm）在含50 g L^-1 NaCl的培养基A中获最高生物量（10 log CFU mL^-1）。预适应150 g L^-1高盐环境后，菌株在Pla-ra基质中存活率提升100倍。新鲜米糠作为载体经两步干燥（55°C 30 min→50°C 120 min）后，细胞存活率>95%。

3.3 发酵过程分析
接种发酵剂后，蛋白酶活性达0.77 nkat mL^-1（对照组0.45 nkat mL^-1）。RT-PCR-DGGE显示Halanaerobium和Lentibacillus等土著菌与添加菌株协同作用。8周发酵产物中S. aureus未检出，而传统样品达3 log CFU g^-1（表5）。

3.4-3.5 代谢组学特征
SPME-GC/MS鉴定57种挥发性物质，PLS-DA分析显示发酵剂组二甲基三硫醚（VIP>1）含量显著升高。¹H-NMR发现47种非挥发性代谢物，其中甜菜碱、甘氨酸在发酵剂组富集，而三甲胺（TMA）含量降低85%。

该研究首次将本土菌株组合应用于Pla-ra工业化生产，通过多组学技术阐明其加速发酵机制。发酵剂不仅将生产周期缩短83%，还通过抑制病原体和丰富风味物质提升产品安全性。值得注意的是，8周发酵产物的代谢物水平超过传统1年发酵产品，提示需优化发酵时间以避免过熟。研究成果为传统发酵食品标准化提供了"微生物组-代谢组"协同调控的新范式，对东南亚发酵水产加工业具有重要实践意义。