RNA结合蛋白hnRNP A/B调控沙门氏菌感染中外泌体miR-27a-5p装载的机制研究

本研究针对沙门氏菌通过外泌体miRNA逃逸宿主免疫的机制，通过TMT定量蛋白质组学和RIP实验，发现hnRNP A/B特异性结合miR-27a-5p并促进其外泌体装载，敲除hnRNP A/B可减少miR-27a-5p外泌体分泌并增强胞内滞留，为阻断细菌免疫逃逸提供新靶点。

　　

沙门氏菌感染是全球畜牧业和公共卫生的重大威胁，其通过调控宿主外泌体miRNA促进免疫逃逸的机制尚不明确。尤其值得注意的是，巨噬细胞在感染后分泌的外泌体中miR-27a-5p显著富集，这种小RNA能抑制周围免疫细胞的炎症反应，但具体装载机制仍是未解之谜。

为解决这一科学问题，来自山东某畜禽育种公司的研究人员在《Poultry Science》发表论文，通过整合Tandem Mass Tag（TMT）定量蛋白质组学、RNA免疫共沉淀（RIP）和CRISPR/Cas9基因敲除技术，系统揭示了hnRNP A/B（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B）作为关键RNA结合蛋白调控miR-27a-5p外泌体分选的分子机制。研究发现，沙门氏菌感染12小时后，巨噬细胞外泌体中383种蛋白显著上调、666种下调，其中hnRNP A/B与miR-27a-5p特异性结合，其敲除使外泌体miR-27a-5p输出减少53%而胞内含量增加2.1倍。该成果为靶向干预细菌免疫逃逸提供了理论依据。

关键技术方法包括：1）采用MOI 20的沙门氏菌ATCC 14028株感染RAW264.7巨噬细胞；2）超速离心结合Umibio?试剂盒分离外泌体；3）TMT标记联合LC-MS/MS分析差异蛋白；4）RIP验证hnRNP A/B与miR-27a-5p互作；5）CRISPR/Cas9构建hnRNP A/B敲除细胞模型。

【RESULTS】

1. Macrophages Secrete Exosomes after Being Uninfected or Infected with Salmonella
   透射电镜显示感染组外泌体呈典型杯状结构（30-200 nm），Western blot验证CD9/CD81/TSG101标志蛋白表达。

2. Salmonella Alters the Profile of RAW264.7 Cell-derived Exosomal Proteins
   PCA分析显示12 h感染组蛋白差异最显著（|log₂FC|≥0.263），其中OmpA等沙门氏菌蛋白被检出，提示病原体蛋白可能通过外泌体传播。

3. GO Enrichment and KEGG Pathway Analysis
   差异蛋白富集于细菌感染疾病（如TLR/NF-κB通路）、翻译调控等通路，网络互作分析揭示hnRNP A/B位于关键节点。

4. The RNA Binding Protein HnRNP A/B is Over Expressed in the Exosome of Salmonella-infected Cells
   Western blot证实沙门氏菌三株系（ST14028/HB173/GL228）感染均使外泌体hnRNP A/B表达上调3.24倍，同期miR-27a-5p外泌体水平升高4.8倍。

5. Hn RNP A/B is Responsible for the Sorting of MiR-27a-5p into Exosomes
   RIP实验显示hnRNP A/B抗体组miR-27a-5p富集量较IgG对照组高6.3倍，基因敲除后外泌体miR-27a-5p降低62%。

【讨论与意义】
该研究首次阐明hnRNP A/B通过识别miR-27a-5p的特定序列（可能含GGAG核心 motif）驱动其外泌体分选。这种机制使沙门氏菌能"劫持"宿主RNA转运系统，通过外泌体递送免疫抑制性miRNA（如miR-27a-5p）来抑制TLR7/NF-κB信号通路。从转化医学角度看，靶向hnRNP A/B-miR-27a-5p轴可阻断细菌的免疫逃逸，为开发新型畜禽抗感染制剂（如基于外泌体装载抑制剂的饲料添加剂）提供理论支撑。未来研究可拓展至其他病原体（如大肠杆菌）是否利用类似机制调控宿主外泌体。