单分子成像揭示MERS-CoV刺突蛋白三聚体在膜融合过程中的预融合中间态构象动态

为解决MERS-CoV（中东呼吸综合征冠状病毒）刺突蛋白（Spike, S）介导膜融合的分子机制不明问题，印度理工学院坎普尔分校的研究团队通过单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术，首次实时观测到全长MERS-CoV S三聚体在膜环境中存在三种预融合中间态构象（高/中/低FRET状态），发现酸性pH和靶膜相互作用可催化S2结构域向融合后构象转变，并阐明S2茎螺旋靶向广谱中和抗体（bnAbs）通过稳定中间态阻断融合的分子机制，为冠状病毒通用疫苗设计提供新靶点。

　　

中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）作为致死率高达35%的高危病原体，其入侵宿主细胞的关键在于刺突蛋白（Spike, S）三聚体介导的膜融合过程。尽管科学家已解析S蛋白的静态结构，但关于其动态构象变化如何驱动膜融合、环境因素（如酸性pH）如何调控这一过程、以及广谱中和抗体如何阻断融合等核心问题仍悬而未决。这些谜题的解答对开发针对MERS-CoV及潜在新发冠状病毒的通用防治策略至关重要。

印度理工学院坎普尔分校的Dibyendu Kumar Das团队在《Cell Reports》发表的研究中，创新性地将单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术与病毒-脂质体重组系统相结合，首次实现了对膜环境中全长MERS-CoV S三聚体构象动态的实时观测。研究通过基因密码子扩展技术在S2结构域的融合肽（FP）附近（904位）和中央螺旋茎区（1111位）特异性引入荧光标记，构建了具有天然活性的双标记S**蛋白。结合HIV假病毒系统和表面等离子体共振成像技术，团队建立了涵盖受体（DPP4）、蛋白酶（TMPRSS2）和靶膜的多维度研究体系。

关键实验方法

1. 单分子FRET成像：在PEG修饰的石英玻片表面固定双标记假病毒颗粒，通过全内反射荧光显微镜（TIRF）实时追踪S2构象变化；
2. 膜融合功能验证：采用DIO标记的病毒与DPP4/TMPRSS2修饰的蛋白脂质体进行脂质混合实验；
3. 抗体中和机制研究：测试6种靶向S2茎螺旋的广谱中和抗体（CC25.106/CC95.108等）对中间态构象的稳定作用；
4. 可逆性实验：通过pH循环切换（4.6?7）验证中间态的热力学特性。

主要研究结果

低pH重塑S2构象景观
在生理pH 7条件下，未结合的S2结构域表现出惊人的动态性，存在四种构象状态：高FRET（0.92±0.07，对应预融合态）、中间态I（0.68±0.05）、中间态II（0.53±0.04）和低FRET（0.17±0.02）。随着pH降低至溶酶体水平（4.6），低FRET状态占比从32%升至89%，表明酸性环境强烈促进FP从疏水口袋释放并向三聚体轴心移动。

受体与蛋白酶的协同调控
DPP4结合通过变构效应使低FRET态占比提升至53%，而TMPRSS2的S2'切割作用更为直接，能在中性pH下诱导71%的低FRET态。两者共存时，酸性pH（4.6）触发85%的S2进入低FRET态，且该转变在靶膜存在时不可逆，证实膜接触是完成6-HB（六螺旋束）形成的必要条件。

抗体稳定中间态的分子机制
S2茎螺旋靶向抗体（如CC25.106）在pH 4.6下仍能维持40%的高FRET态和35%的中间态，显著抑制向低FRET态转变。smFRET过渡密度图（TDP）显示，这些抗体通过阻断中间态II向低FRET态的转化（而非锁定静态构象）实现中和作用。

结论与意义
该研究首次绘制出MERS-CoV S蛋白从预融合到融合后状态的完整构象路径，揭示：1）S2存在三种功能性中间态（中间态I/II/低FRET态）；2）酸性pH和靶膜协同催化不可逆构象转变；3）广谱中和抗体通过"构象捕获"机制稳定中间态。这些发现不仅阐明冠状病毒膜融合的普适性规律，更指出S2中间态可作为设计泛β冠状病毒疫苗的理想靶点。鉴于S2茎螺旋在冠状病毒中的高度保守性，该研究为应对未来可能出现的新发冠状病毒疫情提供了重要理论支撑。