新型限制性进入-阴离子交换有机整体相用于阿尔茨海默病患者脑脊液中同型半胱氨酸和同型半胱氨酸酸的管内固相微萃取-LC-MS/MS分析

为解决阿尔茨海默病(AD)生物标志物检测难题，研究人员开发了一种新型限制性进入-阴离子交换有机整体相，结合管内固相微萃取(in-tube SPME)与LC-MS/MS技术，实现了脑脊液(CSF)中同型半胱氨酸(Hcy)和同型半胱氨酸酸(HCA)的高效分析。该方法线性范围宽(8-250 ng mL-1 Hcy，5-150 ng mL-1 HCA)，可排除90%大分子干扰，首次证实AD患者CSF中Hcy水平显著升高，为AD早期诊断提供了新思路。

　　

阿尔茨海默病(AD)作为最常见的神经退行性疾病，全球每3秒就新增1例患者。尽管β-淀粉样蛋白(Aβ)和磷酸化tau蛋白(p-tau)已被确立为AD的脑脊液(CSF)生物标志物，但它们无法预测疾病 onset。这促使科学家寻找更早期的预警信号——同型半胱氨酸(Hcy)及其氧化代谢产物同型半胱氨酸酸(HCA)因此进入视野。Hcy不仅是AD独立风险因子，其神经毒性衍生物HCA还能激活NMDA受体加剧神经元损伤。然而，CSF中这两种物质的检测面临巨大挑战：浓度极低（ng/mL级）、基质复杂（含大量蛋白质），传统方法难以兼顾选择性与灵敏度。

来自圣保罗研究基金会支持的研究团队在《Analytica Chimica Acta》发表突破性成果。他们首创性地将限制性进入材料(RAM)与阴离子交换功能整合到有机整体相中，开发出"双功能"萃取材料，结合管内固相微萃取(in-tube SPME)与LC-MS/MS技术，建立了CSF中Hcy/HCA的超灵敏分析方法。研究采用AD患者、轻度认知障碍(MCI)患者及健康对照者的CSF样本，首次系统揭示了Hcy在AD病程中的变化规律。

关键技术方法
研究通过优化乙烯基二甲基丙烯酸酯(EGDMA)交联剂与[2-（甲基丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵(META)功能单体比例，制备具有分级孔结构的有机整体相；采用人工CSF验证大分子排除效率；建立在线in-tube SPME-LC-MS/MS联用系统，以同位素标记物(Hcy-d₄/HCA-d₄)为内标，实现8-250 ng mL^-1 Hcy和5-150 ng mL^-1 HCA的准确定量。

研究结果
优化合成条件
通过调节EGDMA/META比例(1:1至1:4)和致孔剂组成，获得最佳渗透性(2.5×10^-14 m²)与萃取效率的平衡。红外光谱证实季铵基团成功引入，扫描电镜显示10-50 μm贯通大孔与0.5-2 μm介孔共存的结构。

方法学验证
在优化流速(0.3 mL/min)和采样体积(10 mL)下，方法回收率达92-105%，RSD<8%。亲水外层排除90%牛血清白蛋白(BSA)，基质效应<15%。相比传统液液萃取，灵敏度提升20倍。

临床样本分析
AD组CSF中Hcy浓度(189±34 ng mL^-1)显著高于MCI组(132±28 ng mL^-1)和对照组(85±19 ng mL^-1)，ROC曲线下面积达0.89，显示良好鉴别力。HCA水平虽无统计学差异，但与Hcy呈正相关(r=0.72)。

结论与意义
这项研究创造了三个"首次"：首例兼具RAM与阴离子交换功能的有机整体相；首个实现CSF中Hcy/HCA同步检测的in-tube SPME方法；首次明确Hcy作为AD分级诊断标志物的临床价值。该工作不仅为神经退行性疾病研究提供了新工具，更揭示了硫氨基酸代谢异常在AD发生中的关键作用。特别是Hcy在MCI阶段的升高趋势，暗示其可能成为AD超早期预警的"分子灯塔"，为干预治疗赢得黄金时间窗。未来研究可进一步探索Hcy/HCA比值与Aβ沉积的时空关系，推动AD多标志物联合诊断体系的建立。