揭示乙酰胆碱杆菌Putrescine N-单加氧酶FbsI活性位点残基对底物结合和辅因子特异性的分子机制

本研究针对多重耐药性乙酰胆碱杆菌铁载体合成关键酶FbsI，通过定点突变和生化分析揭示T240、D390和K223残基在底物结合与NADPH特异性识别中的核心作用。发现K223R突变使NADPH结合亲和力提升15倍，为靶向铁代谢的抗菌药物设计提供新靶点。

　　

铁载体作为病原菌获取铁元素的关键毒力因子，其生物合成途径正成为对抗多重耐药菌的新靶点。乙酰胆碱杆菌（Acinetobacter baumannii）作为医院获得性感染的主要病原体，能产生包括fimsbactin A在内的三类铁载体。其中fimsbactin A的合成需要将腐胺（putrescine）转化为N-羟基腐胺，该反应由黄素依赖的N-羟基化单加氧酶FbsI催化完成。尽管FbsI的三维结构已被解析，但其活性位点残基的精确功能仍不清楚。

美国弗吉尼亚理工大学的Pablo Sobrado团队在《Archives of Biochemistry and Biophysics》发表的研究，通过整合结构生物学与酶动力学方法，系统探究了FbsI活性位点关键残基的功能。研究采用定点突变技术构建T240A、D390A/N和K223A/R突变体，结合稳态动力学分析、快速反应停流光谱测定辅因子解离常数（K_D）和还原速率（k_red），并借助多序列比对验证残基保守性。

【Identification of Active Site Residues】章节显示，基于FbsI-FAD-NADP⁺复合物结构（2.2 ?）的分子对接预测，T240和D390可能通过氢键网络稳定腐胺结合。实验证实T240A突变导致腐胺K_M值增加500倍，证实其底物结合关键作用；D390突变则导致蛋白失活，提示其在催化中的不可替代性。

【Materials】部分详述了采用pET28a载体在E. coli BL21(DE3)中表达重组蛋白，通过镍柱亲和层析纯化获得野生型和突变体酶。动力学参数测定使用紫外-可见分光光度法监测NADPH在340 nm处的吸光度变化。

【Discussion】指出K223残基的电荷特性决定辅因子特异性：K223R突变使NADPH的K_D降低15倍，而K223A则导致k_red下降7.5倍。这一发现揭示了FMOs家族中罕见的"精氨酸开关"机制，为理解Class B单加氧酶的辅因子识别模式提供了新视角。

该研究首次阐明FbsI活性中心的"三位一体"功能模块：T240负责底物定位，D390维持催化微环境，K223调控辅因子选择。这些发现不仅深化了对NMOs催化机制的理解，更为设计靶向铁载体合成通路的新型抗菌药物奠定了分子基础。特别值得注意的是，K223R突变体展现的增强型NADPH特异性，为工业酶改造提供了新的工程化策略。