工程化酿酒酵母通过纤维二糖发酵克服葡萄糖抑制实现果胶类生物质高效转化

本研究针对果胶类生物质发酵过程中低pH和葡萄糖抑制(GalUA/Xyl共利用受限)的行业难题，通过适应性实验室进化(ALE)获得携带cdt-1(M128I/L167H)突变的DH1菌株，使纤维二糖(Cel)摄取能力提升20倍，NADPH利用率提高3倍，乳酸产量达38.2 g/L(较葡萄糖对照组提升46.4%)，为酸性环境下果胶废弃物高值化转化提供了创新解决方案。

　　

在追求可持续发展的今天，利用农业废弃物生产高附加值化学品已成为生物制造领域的热点。果胶类生物质（如柑橘皮、苹果渣）因其富含半乳糖醛酸(GalUA)、木糖(Xyl)和纤维素而备受关注，但这类原料存在两大天然屏障：一是水解后产生的酸性环境(pH≈3.5)，二是葡萄糖对其它碳源的代谢抑制。传统酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)不仅难以在低pH下有效利用GalUA，其固有的"葡萄糖抑制"效应更会阻碍混合糖的共代谢。

针对这一行业痛点，来自普渡大学的研究团队在《Bioresource Technology》发表创新成果。研究人员巧妙选择纤维二糖(Cel)作为突破口——这种由两个葡萄糖分子组成的二糖，在细胞内经β-葡萄糖苷酶(GH1-1)分解后，可绕过葡萄糖抑制机制。通过将Neurospora crassa来源的纤维糊精转运蛋白(CDT-1)和GH1-1基因导入能代谢Xyl/GalUA的YE9菌株，结合长达1140小时的适应性进化，最终获得携带CDT-1(M128I/L167H)双突变的DH1超级菌株。

关键技术包括：1）CRISPR/Cas9系统构建乳酸脱氢酶(LDH)整合菌株；2）氧限制条件下的长期适应性进化；3）SWISS-MODEL预测突变蛋白结构；4）HPLC监测混合糖代谢动态；5）EnzyChrom法测定NADPH/NADP⁺比值。研究特别选用橙子加工废料(OPW)作为真实底物验证，通过Viscozyme? L和果胶酶预处理保留Cel。

【3.1节】进化后的eYE9C-#7菌株在pH3.5下表现出惊人适应性：Cel消耗速率达0.791 g/L·h（较初始菌提升20倍），GalUA利用率提高3倍。结构分析显示，L167H突变位于CDT-1胞外区，通过组氨酸的质子缓冲作用稳定了酸性环境下的转运活性；而M128I则扩大了跨膜通道直径，促进Cel内流。

【3.3节】代谢重编程带来意外收获：以Cel替代葡萄糖时，DH1菌株的NADPH/NADP⁺比值在36小时仍维持高位（0.82 vs 葡萄糖组的0.31），这为GalUA途径的关键酶——D-半乳糖醛酸还原酶（NADPH依赖型）提供了充足辅因子。在40 g/L Cel+10 g/L Xyl条件下，GalUA消耗量达13.02 g/L，较葡萄糖对照组提升44%。

【3.4节】应用转化令人振奋：整合LDH的DH1-LDH在OPW水解液中实现5.7 g/L乳酸产量（2.7倍于对照），且乙醇产量未受显著影响。晶体结构解析揭示，双突变协同作用——L167H优化了底物结合口袋的电荷分布，而M128I则使跨膜区自由体积增加12%，共同解决了酸性pH下转运效率骤降的难题。

这项研究突破了果胶类生物质转化的两大技术瓶颈：通过CDT-1的定向进化实现了pH3.5下的高效Cel转运，利用细胞内葡萄糖释放机制巧妙规避了碳分解代谢抑制(CCR)。更值得关注的是，该策略使乳酸等非乙醇产品的碳转化率提升46.4%，为构建"糖平台-产品谱"的生物精炼模式提供了新思路。未来通过整合更多耐酸元件（如质子泵基因），有望进一步拓展酸性工业环境下生物制造的边界。