便携式分子诊断技术在海洋哺乳动物DNA病毒现场检测中的应用与验证

为解决海洋哺乳动物病毒性传染病监测难题，研究人员利用便携式Biomeme Franklin?实时qPCR仪开发了针对疱疹病毒、痘病毒和环状病毒的分子检测技术。通过合成标准模板验证，该技术展现出与实验室设备相当的灵敏度和特异性，为资源有限地区的病原体监测提供了快速、准确的解决方案，对海洋生态健康及人兽共患病防控具有重要意义。

　　

海洋哺乳动物作为海洋生态系统的旗舰物种，其健康状态直接反映海洋环境质量。过去30年间，与传染病相关的海洋哺乳动物群体死亡事件（ID-MMEs）显著增加，其中病毒被确认为主要诱因。尤其值得注意的是，人类与海洋哺乳动物的接触日益频繁，从科研人员到水族馆员工均面临人兽共患病风险，例如海豹副痘病毒（SEPPV）可通过皮肤病变传播给人类。然而，传统实验室检测方法受限于样本运输中的核酸降解、细胞培养难度及抗体稀缺等问题，亟需开发适用于野外场景的即时检测（POCT）技术。

针对这一需求，韩国国立水产科学院渔业科学研究所联合多家机构的研究人员，在《Ecotoxicology and Environmental Safety》发表研究，首次利用便携式Biomeme Franklin?实时定量PCR（qPCR）仪，建立了针对海洋哺乳动物DNA病毒的现场诊断体系。该研究聚焦五种关键病毒：瓶鼻海豚疱疹病毒（BDHV）、海豹副痘病毒（SEPPV）、海豹环状病毒2/4型（SEAV2/4）及南极毛皮海豹扭矩特诺病毒5型（TTV5），通过合成生物学技术构建病毒标准模板，优化qPCR引物，并对比便携设备与实验室级QuantStudio 3的性能差异。

关键技术方法包括：1）从搁浅鲸类采集组织样本；2）基于NCBI数据库筛选病毒保守序列，合成500 bp标准模板并克隆至载体；3）设计针对病毒DNA聚合酶、ORF1等靶点的特异性引物；4）使用Franklin便携qPCR仪与QuantStudio 3并行检测，评估灵敏度（10⁰-10⁹ copies/μL梯度）和特异性；5）模拟临床样本通过鲸肝DNA加标实验验证抗干扰能力；6）采用机器学习模型VirPipe预测病毒人畜共患潜力。

研究结果揭示：
3.1 病毒人畜共患风险预测
SEPPV和SEAV2被归类为中等风险（ZPS评分0.29-0.45），而SEAV4和TTV5显示高传播风险（平均ZPS>0.29），提示需加强监测。

3.3 便携设备灵敏度验证
Franklin对BDHV的检测下限达10⁴ copies/μL，对SEPPV/SEAV2可达10³ copies/μL，虽略低于QuantStudio 3的10² copies/μL，但满足临床需求。回归分析显示两者R²>0.98，具有高度一致性。

3.4 特异性验证
所有引物在两种设备上均仅对目标病毒产生信号（Ct<30），非靶标病毒Ct>30，且鲸组织DNA未引发交叉反应，证实方法特异性。

3.5 加标样本性能
在含10 ng鲸肝DNA的复杂基质中，Franklin仍可稳定检出10⁴ copies/μL的病毒模板，Ct值偏移仅1-2个周期，表明抗干扰能力优异。

讨论部分指出，该研究首次将合成生物学与便携qPCR结合，解决了海洋病毒阳性样本获取难的瓶颈。尽管Franklin在低浓度检测稳定性上存在局限，但其5小时续航、1.2 kg便携性及智能手机操控特性，使其特别适合远洋科考和野生动物救援。研究者建议未来优化样本前处理流程，并扩展至RNA病毒检测。

这项研究的核心价值在于：1）建立了可存储的病毒标准品库，突破生物样本跨境运输限制；2）为《生物多样性公约》框架下的海洋病原监测提供标准化工具；3）通过早期预警降低人兽共患病暴发风险。正如作者强调，便携分子诊断技术的推广，将推动“海洋健康-动物健康-人类健康”的一体化防控体系构建。