合成与牛源乳清蛋白的蛋白质组学及N-糖基化比较及其对人类肠道微生物组的体外影响

这篇研究通过质谱技术对比了酵母合成与牛源乳清蛋白的蛋白质组成及N-糖基化（N-glycome）差异，发现尽管两者均以β-乳球蛋白（β-lactoglobulin）为主，但酵母合成蛋白的N-糖基化以甘露糖型为主，而牛源蛋白则富含复杂结构（如唾液酸化N-糖链）。体外发酵实验表明，这种差异显著影响人类肠道微生物组（gut microbiome）的多样性和特定菌科（如Akkermansiaceae）的丰度，提示新型生物技术食品需关注糖基化对肠道生态的潜在影响。

　　

ABSTRACT

食品技术的进步推动了酵母合成乳清蛋白的商业化，但其与牛源乳清蛋白的生物活性差异尚不明确。本研究通过蛋白质组学和N-糖基化分析，结合体外微生物发酵模型，揭示了两种蛋白在结构与功能上的关键差异。

INTRODUCTION

全球对可持续蛋白质的需求催生了酵母合成乳清蛋白技术。尽管其感官特性接近牛乳清，但哺乳动物与酵母的糖基化机制差异可能影响蛋白质功能。牛奶作为复杂生物流体，其乳清蛋白（如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白）的天然糖基化模式难以完全复制，而糖基化修饰（如N-糖链）已知影响蛋白质与微生物组的互作。

MATERIALS AND METHODS

蛋白质纯化与质谱分析
牛源乳清蛋白（WPI）与市售酵母合成乳清蛋白经乙醇沉淀纯化后，通过SDS-PAGE和LC-MS/MS进行蛋白质组分析。数据非依赖采集（DIA）技术用于肽段鉴定，并映射至牛乳特异性蛋白数据库。

N-糖基化分析
PNGase F酶解释放的N-糖链经2-AA标记后，通过MALDI-TOF MS检测。牛源样本鉴定出78种结构（包括复杂/杂化型及唾液酸化糖链），而酵母样本仅检出22种高甘露糖型结构。

体外微生物发酵
三种人类肠道微生物群落（基于16S rRNA测序分型）在厌氧条件下分别以牛源/酵母乳清蛋白为唯一碳源培养。12/24小时后，通过16S测序评估菌群组成变化，并采用ANCOM-BC分析差异菌科。

RESULTS

蛋白质组差异
酵母合成乳清中β-乳球蛋白占比高达98%，显著高于牛源样本（83%）。牛源样本还含有α-乳白蛋白、乳铁蛋白等，且蛋白多样性更高（Bray-Curtis差异显著，P<0.01）。

N-糖基化特征
牛源样本中67种N-糖链为独有（如唾液酸化Hex₅HexNAc₄NeuAc₁），而酵母样本仅含高甘露糖型（如Hex₉HexNAc₂）。中性糖链在酵母样本中占比超90%，而牛源样本中复杂/酸性糖链达80%。

微生物组响应
牛源蛋白显著提升所有群落α多样性（24小时Shannon指数，P<0.001），且群落E1中Akkermansiaceae（黏蛋白降解菌）持续富集。酵母样本则仅在群落E1中诱导Bacteroidaceae增长。值得注意的是，牛源蛋白的复杂糖链可能为特定菌群（如Veillonellaceae）提供发酵底物。

DISCUSSION

酵母合成乳清蛋白虽在核心蛋白组成上接近牛源产品，但其简化的N-糖基化模式可能限制其对肠道菌群的调控作用。牛源蛋白的复杂糖链结构（如唾液酸化修饰）或通过提供特殊碳源塑造菌群生态。未来需关注：1）糖基化工程优化酵母合成蛋白功能；2）体内验证糖链-菌群互作机制；3）评估长期摄入对宿主代谢的影响。

ACKNOWLEDGMENTS

研究得到美国农业部（USDA-NIFA #13385133）及国立卫生研究院（NIH GM103440/GM104944）资助，并依托内华达大学蛋白质组学平台完成。